霞浦縣獸醫實驗室非洲豬瘟檢測能力比對及分析

左璐雅 霞浦縣動物疫病預防控制中心 福建霞浦 355100

2019 年以來，福建省動物疫病預防控制中心分批次組織各建設完成病原學PCR實驗室的動物疫病預防控制機構實驗室進行非洲豬瘟檢測能力比對。2019年12月，霞浦縣動物疫病預防控制中心申請參加比對試驗，專人負責在指定時間領取比對試驗盲樣，試劑不作統一發放，按照要求在規定時間完成實驗室檢測過程，出具檢測報告。現將霞浦縣獸醫實驗室參加非洲豬瘟檢測能力比對試驗的情況匯總如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測試劑盒（熒光探針法），唐山怡安生物工程有限公司生產，試劑盒中樣本裂解液和樣本稀釋液儲存于2～8℃，其余組分避光條件下儲存于-20±5℃。

1.2 方法

1.2.1 樣品及預處理 4份血清樣品均來自福建省動物疫病預防控制中心提供盲樣，放置于室溫（18～25℃）平衡備用。用樣本稀釋液進行5倍稀釋后，取5μL直接上樣。

1.3 熒光PCR擴增

1.3.1 擴增試劑準備 從試劑盒中取出PCR反應液、陰性對照、陽性對照，待所有組分完全溶解后，振蕩混勻5 s，瞬時離心5 s。

1.3.2 配制反應體系 在0.2 mLPCR管中配制反應體系，ASFV-PCR反應液20μL，經預處理的樣本（或陰性/陽性對照）5μL，總體積25μL，操作完畢壓緊管蓋，瞬時離心。

1.3.3 設置反應條件 按表1設置反應條件。

表1 擴增反應條件

1.3.4 熒光通道的選擇 選擇FAM通道檢測ASFV核酸。

1.4 判定

1.4.1 質控標準 陰性對照的FAM檢測通道無S型擴增曲線。陽性對照的FAM檢測通道有典型S型擴增曲線，且Ct值≦23。陰性對照和陽性對照檢測均符合上述結果，則試驗有效，否則試驗無效。

1.4.2 結果判定 如果樣本在FAM檢測通道無典型S型擴增曲線且無Ct值，判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陰性。如果樣本在FAM檢測通道有典型S型擴增曲線，且Ct值≦23，判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陽性。

2 結果與分析

陽性對照Ct值為19.6，陰性對照無Ct值，判定試驗有效。4份檢測樣品中有1份為陽性，其余3份均為陰性（見表2）。

表2 非洲豬瘟檢測能力比對數據統計

參加該次非洲豬瘟檢測能力比對，霞浦縣獸醫實驗室的檢測能力合格，但在過程中凸顯出幾點問題值得注意和思考。

一方面是2019年以前尚未建設病原學PCR實驗室，獸醫實驗室主要承擔血清學檢測，對病原學檢測相關知識知之甚少，經驗不足。另一方面是進行病原學試驗，對生物安全水平的要求非常高，一旦操作不規范很容易造成污染；同時，試驗結束后要認真對樣品進行無害化處理。實驗室人員要舉一反三，迅速掌握檢測技術要點。