基于網絡藥理學分析右歸丸治療糖尿病性勃起功能障礙的作用機制

翟新宇 談鳴岳 葛旻垚 萬 眾 徐東亮

上海中醫藥大學附屬曙光醫院泌尿中心（上海 201203）

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction,DED）是糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）常見的慢性并發癥之一，主要表現為陰莖不能達到或維持足夠的勃起以完成滿意的性生活，病程在3個月以上。中國是DM第一大國，70%的DM男性患者都會引發不同程度的勃起功能障礙（erectile dysfunction,ED）[1]。正常人群的ED發病率僅為18%，而DM人群的ED發病率是正常人群的4倍，發病時間較正常人群要早10年，并隨著年齡的增長和DM病程的延長發病率呈逐漸上升趨勢[2-3]。DED的發生嚴重影響患者的生活質量、心理健康及夫妻感情，甚至影響社會的和諧穩定。因此，積極治療DED具有重要的臨床意義。

幾千年來，中醫藥一直被用來治療一系列疾病。由于中醫藥療效顯著，副作用小，已被世界各地越來越多的人所認可[4]。右歸丸是由明代著名醫學家、溫補學派創始者張仲景所創，由附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、當歸、杜仲、菟絲子10種中草藥組成。該方劑具有“滋陰補腎、填精止遺”的功效，先前的臨床研究證實，右歸丸具有良好的改善糖尿病性勃起功能障礙的作用[5]。然而，對于右歸丸治療糖尿病性勃起功能障礙的作用機制尚不清楚，其主要成分和關鍵靶點的藥效學性質尚待確定。

網絡藥理學可以通過不同層次的網絡構建系統地揭示藥物作用靶點與疾病靶點之間的關系，從微觀層面觀察復雜藥物對多靶點疾病的干預和影響[6]。網絡藥理學研究策略的整體性、系統性與中醫的整體理念和辨證論治理論不謀而合，為中醫藥的現代醫學解讀提供了一條新穎的路徑[7]。鑒于臨床獲得右歸丸治療DED患者海綿體樣本的倫理局限性，我們采用網絡藥理學的方法篩選右歸丸中各單味藥的活性成分及作用靶點，檢索已知的DED相關靶點，對右歸丸干預DED的潛在關鍵作用靶點的生物功能進行預測，并分析其作用通路，為揭示右歸丸的科學內涵和進一步挖掘右歸丸其他臨床應用奠定基礎。

材料與方法

一、右歸丸活性成分篩選及潛在作用靶點預測

本研究利用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID數據庫(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)收集右歸丸中各味中藥相關的活性成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選標準[7]，得到符合條件的活性成分靶點信息。

二、疾病靶點的預測

登錄GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數 據 庫（https://omim.org/），以“糖 尿 病性勃起功能障礙”為關鍵詞，檢索篩選出疾病相關基因，通過Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）進行確認并轉換后，剔除重復靶標，整理成DED疾病靶點數據庫。

三、中藥活性成分-靶點網絡構建

將中藥活性成分相關靶點與疾病相關靶點取交集，通過韋恩圖將其可視化，并利用Cytoscape3.7.2軟件構建中藥-活性成分-靶點網絡圖。

四、PPI網絡的構建和核心靶點的篩選

將得到交集基因的信息導入在線數據庫STRING（http://string-db.org/），篩選最小相關分數大于0.4的節點，去除無關聯的單個節點，獲得的剩余節點及關系導入Cytoscape3.7.2軟件繪制PPI網絡，并通過計算每個節點的degree值篩選出核心靶點。

五、靶點基因生物信息富集分析

將右歸丸作用靶點導入DAVID數據庫（https://DAVID.ncifcrf.gov），限定物種為人，進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，篩選P<0.05的生物過程及信號通路，取排名前20條信號通路用R包（ggplot2）繪圖將其可視化。

六、基因-通路網絡構建

為進一步篩選出明顯富集在通路中的核心作用靶基因，利用Cytoscape3.7.2構建基因-通路網絡圖。

圖1 右歸丸治療DED的網絡藥理學分析流程圖

結 果

一、右歸丸活性成分及作用靶點信息收集

通過TCMSP、TCMID平臺檢索符合標準的右歸丸活性成分，剔除重復值后共86個。其中附子有效成分6個，作用靶點20個，當歸有效成分2個，作用靶點53個，杜仲有效成分23個，作用靶點216個，枸杞子有效成分35個，作用靶點208個，鹿茸膠有效成分1個，作用靶點4個，肉桂有效成分1個，作用靶點19個，山藥有效成分12個，作用靶點80個，山茱萸有效成分14個，作用靶點70個，熟地黃有效成分2個，作用靶點31個，菟絲子有效成分10個，作用靶點222個，將所獲得的活性成分預測靶點導入Uniprot數據庫進行基因標準化，去除重復值，共得到作用靶點基因227個。

二、糖尿病性勃起功能障礙靶點的收集

使用GenCards數據庫獲得相關靶點784個，OMIM數據庫獲得295個，刪除重復值，合并后共收集到DED潛在靶基因1061個。

三、中藥-疾病交集基因韋恩圖

計算得到右歸丸與DED交集靶點78個，說明右歸丸可能通過以上78個靶點作用于DED，并用R包繪圖將其可視化，見圖2。

圖2 藥物-疾病交集基因韋恩圖

四、中藥-活性成分-靶基因網絡分析

將78個作用靶點所對應的中藥活性成分，運用Cytoscape3.7.2軟件構建中藥-活性成分-靶基因網絡（見圖3），網絡中共有152個節點和365條邊，包含74種活性成分，78個作用靶點，每條邊表示化合物和靶點之間的相互作用關系。經過和核心靶基因對比篩選，獲得degree值排名前五的核心中藥活性成分信息及對應靶點數目，見表1。

圖3 中藥-活性成分-靶點網絡

表1 核心中藥活性成分信息及對應靶點數目

五、PPI網絡分析

將得到交集基因的信息導入在線數據庫STRING，篩選minimum required interaction score大于0.4的節點，去除無關聯的單個節點，獲得的剩余節點及關系導入Cytoscape3.7.2軟件繪制PPI網絡。得到的網絡圖由77個節點和737條邊組成；進一步按degree值進行篩選，根據“右歸丸-活性化合物-潛在作用靶點”網絡與PPI網絡中的關鍵作用靶點相互映射，推測右歸丸的有效成分可能通過VEGFA（degree值51）、IL-6（degree值50）、CASP3（degree值44）、NOS3(degree值39)、IL-1β(degree值38)這5個核心靶點發揮改善糖尿病性勃起功能障礙的作用，見圖4。

圖4 右歸丸核心蛋白網絡互作圖

六、GO功能富集與KEGG通路富集分析

將得到78個作用靶點通過DAVID數據庫進行GO與KEGG富集分析，共有1509條生物功能顯著富集（P＜0.05），見圖5。1332個在生物過程（BP）中富集，75個在細胞成分（CC）中富集，100個在分子功能（MF）中富集。選擇排名前20的GO中條目繪制柱狀圖，主要涉及抗菌反應、脂多糖反應、細菌分子反應、活性氧水平反應、第二信使介導信號轉導、乙醇反應、G蛋白-偶聯第二信使環核苷酸受體信號通路等生物過程。細胞成分（CC）主要有：膜筏、膜微域、膜區、神經元胞體等。分子功能（MF）為：G蛋白-偶聯胺受體活性、細胞因子受體結合、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合、銨離子結合、核受體活性等。KEGG通路網絡分析結果顯示，富集靶基因數目較多，且具有較大意義的通路為：神經活性配體-受體相互作用信號通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物-受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化信號通路、鈣信號通路等，見圖6。

圖5 GO分析得出的排名前二十條目的BP、CC、MF氣泡圖

圖6 KEGG富集分析前二十條信號通路

七、基因-通路網絡分析

將排名前20的KEGG通路信息和相應富集在這些信號通路上的基因導入Cytocape3.7.2軟件構建基因-通路網絡，見圖7。網絡包含70個節點，203條邊，其中富集基因50個，信號通路20條。將這些節點進行分析，degree值越大，圖形面積越大，代表目標基因或通路在網絡中發揮的作用越大。

圖7 富集基因-KEGG信號通路圖

討 論

糖尿病性勃起功能障礙是在糖尿病進展過程中出現的一種慢性并發癥，并隨著病程的延長，發病率呈上升趨勢。DED的發病機制復雜，涉及多基因、多靶點的病理機制，目前主要學說涉及神經病變、血管內皮細胞病變、雄激素水平改變等[8]。一線治療主要為口服西地那非，但有增加心腦血管意外的風險。近年來，中醫藥治療DED的研究逐漸增多，因其安全性高、不良反應小、患者接受度好，在臨床應用上逐漸被認可。

中醫雖沒有DED的病名，但糖尿病屬中醫“消渴病”范疇，勃起功能障礙屬“陽痿”范疇，DED可認為是消渴所致陽痿。陽痿病機主要是腎陽虧虛，命門火衰，陰器冷縮，痿而不起。而腎陽不足是源于消渴日久，耗傷真陰，導致腎精虧損。由于陰陽互根互用，病程日久，必陰損及陽，導致腎陰陽兩虛。消渴所致陽痿是以腎陽虛為主要矛盾的陰陽兩虛之證，治療當以溫腎填精、壯陽起痿為主，同時兼顧補腎滋陰。右歸丸是明代著名醫學家、溫補學派創始者張景岳所創制的陰中求陽代表方。方中用滋陰藥“熟地黃、枸杞子、酒萸肉、山藥、當歸”補養精血以培其本，再配合補陽藥“炮附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、鹽杜仲”溫腎壯陽，諸藥陰陽雙補，陰中求陽，使陽氣得陰生化無窮，可以溫腎填精、壯陽起痿，主治命門火衰之證。右歸丸方證與消渴所致陽痿病機吻合，故中醫用藥常選用右歸丸治療DED，并佐以臨證加減。

網絡藥理學從藥物、疾病之間相互作用的整體性和系統性出發，采用復雜網絡模型表達和分析研究對象的藥理學性質，為中藥多成分、多途徑和多靶點的作用機制進行整合及闡明，為基礎實驗研究提供方向。

結果發現，槲皮素、Cinchonan-9-al,6'-methoxy-,(9R)-、(-)-Tabernemontanine（丹參堿）、山奈酚、β-谷甾醇可能是右歸丸治療的DED的主要活性成分。其中槲皮素與山奈酚均屬黃酮類化合物，已有多項研究證實[9-10]，黃酮類物質具有抗氧化、抗炎、抗心腦血管疾病等藥理活性，有效抑制炎癥及纖維化的進展，在治療糖尿病相關并發癥中起到重要作用。其中，槲皮素可以有效降低醛糖還原酶的活性，降低AGE的生成，抑制AGERAGE信號通路引起的糖尿病組織（如糖尿病腎臟、糖尿病心臟）相應的氧化應激、細胞凋亡等病理過程[11]，同時能改善DM-ED模型大鼠的血管內皮功能，增加陰莖海綿體血管平滑肌竇壓(ICP)，增強一氧化氮合酶的活性和亞型的表達[12]。山奈酚屬于過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑，具有增強脂肪組織及骨骼肌葡萄糖儲運的作用，能夠提高胰島素敏感性，被廣泛地應用于糖尿病及相應并發癥的治療。山奈酚可通過調節血管活性相關因子的動態平衡，從而發揮對微血管病變的保護作用[13]。β-谷甾醇是動植物細胞膜重要的組成之一，具有抗氧化、抗炎、降血糖等藥理活性。研究發現[14]，β-谷甾醇可以有效清除氧自由基，降低細胞內過氧化物酶的水平，發揮抗氧化作用；通過抑制巨噬細胞IL-6活性，減少IL-1、TNF等炎性因子的分泌，起到抗炎的作用。因此，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可能是右歸丸改善DED的關鍵成分。

通過對活性成分-疾病靶點分析，根據度值的大小得出右歸丸與DED相互作用的關鍵節點有VEGFA、IL6、CASP3、NOS3、IL1β。VEGF家族是一類多功能的細胞因子，在血管生成中具有重要的調控作用。在大鼠和人陰莖組織的內皮細胞和平滑肌細胞中都發現了VEGF信號傳導途徑[15-16]，在大鼠陰莖海綿體內注射VEGF，可以有效改善ED[17-18]。IL-6、IL-1β為兩種炎癥因子，隨著糖尿病病程的延長，組織分泌大量的炎癥介質及細胞因子，降低炎癥介質及細胞因子對于糖尿病相關并發癥的治療至關重要。NOS3是內皮型一氧化氮合酶，NOS3催化左旋精氨酸產生NO是陰莖勃起的關鍵物質，糖尿病大鼠陰莖海綿體組織內的NOS活性顯著降低且隨糖尿病病程的延長而下降，引起陰莖海綿體局部NO水平降低，導致ED[19-20]。CASP3是細胞凋亡的標志性蛋白，隨著糖尿病病程的進展，患者糖、脂代謝紊亂使全身大動脈發生粥樣硬化，血管、微血管病變，導致海綿體缺血、缺氧，海綿體平滑肌數量減少，纖維化程度增加及海綿體細胞凋亡增加，同時發生陰莖海綿體白膜纖維減少，最終促使DED發生，眾多研究均已證實細胞凋亡在DED的發生、發展過程中扮演一定角色[21-22]。右歸丸中篩選出的核心成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇均對炎癥因子有不同程度的控制。本研究篩選出來的關鍵活性成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可以有效控制氧化應激反應、減輕糖尿病的炎癥反應、降低血管內皮細胞凋亡蛋白表達、保護血管內皮等功能[23-25]，臨床上可能通過調控這些關鍵靶點從而發揮改善DED的作用。

從GO分析可知，右歸丸可通過對多種生物學過程和和分子功能的調控來改善DED的發生發展，核心靶點主要富集在生物過程（BP）環節，其關聯的生物過程主要有調節參與抗菌反應、脂多糖反應、細菌分子反應、活性氧水平反應等。糖尿病是一種慢性炎癥反應，可以啟動多條信號通路，導致機體氧化應激反應從而引起全身血管炎癥因子釋放增加，進而引起血管平滑肌增生、血管粥樣硬化，血管內NO釋放降低，促發DED的發生[26-27]。根據KEGG的富集結果可知，右歸丸作用于DED的核心靶點主要富集在神經活性配體-受體相互作用信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路。糖尿病引起的神經病變是發生ED的重要原因[28]。自主神經病變可以引起陰莖靜脈漏的形成,而周圍神經病變可引起神經反射傳導障礙,支配陰莖的舒血管腸肽能、膽堿能腎上腺素能神經損壞,導致與陰莖勃起有關的神經遞質濃度改變,最終導致ED。AGE-RAGE信號通路激活可直接滅活NO或間接減少NO生成，增加縮血管因子水平，同時還能引起海綿體組織內氧化應激反應，導致血管炎癥因子產生增多、血管內皮細胞凋亡，從而引發ED，抑制該信號通路可有效改善DED[29]。PI3K-AKT信號通路為細胞內重要信號轉導通路之一，是細胞功能的關鍵調節因子。該信號通路激活，可有效增加陰莖海綿體平滑肌細胞內NO含量，進而改善DED[30-31]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學明確了右歸丸主要通過VEGFA、IL-6、CASP3、NOS3、IL-1β等靶點調節神經活性配體-受體相互作用信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路進而改善DED，但本研究結果有待于后期進一步實驗驗證。