高糖誘導陰莖海綿體內皮細胞損傷關鍵基因的篩選和生物信息學分析*

馬 帥 陳 穎 齊 濤 李世雄 楊文濤 陳 俊**

1.廣西壯族自治區南寧市廣西中醫藥大學研究生學院（廣西南寧 530200）

2.廣東省廣州市中山大學附屬第三醫院不育與性醫學科（廣東廣州 510631）

3.廣西壯族自治區南寧市廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院男性科（廣西南寧 530012）

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction,DED）是糖尿病最主要的并發癥之一，是難治性ED，嚴重影響著患者及其配偶的生活質量和心理健康[1]。盡管目前ED的治療方法有很多，如口服PDE-5抑制劑、陰莖海綿體藥物注射以及假體植入等，但治療DED的效果均欠佳，究其原因在于DED的發病機制不清[2,3]。因此，研究DED的發病機制，探索新的、有效的DED治療方法迫在眉睫。

隨著生物信息學技術的不斷發展和應用，對基因芯片數據的挖掘和利用已成為生物醫學的研究熱點，為DED的基礎研究提供了新的思路[4,5]。研究表明，DED的發生和發展與陰莖海綿體內皮細胞受損密切相關[6]。本研究擬對模擬血糖紊亂病理狀況下的小鼠陰莖海綿體內皮細胞的轉錄譜RNA-seq測序數據進行分析，構建差異基因的蛋白質相互作用網絡，進行GO功能富集分析，篩選核心差異基因，以期為DED治療開發新的藥物靶點提供思路和理論基礎。

材料方法

一、芯片數據的選擇與分析

在GEO數據庫中檢索編號為GSE146078的芯片表達譜為研究對象。該芯片是模擬持續高糖環境導致陰莖內皮細胞損傷，正常（5 mmol/LD-葡萄糖）對照組和高糖（30 mmol/LD-葡萄糖）處理72小時組的小鼠陰莖海綿體內皮細胞的轉錄譜RNAseq測序數據[7]。采用檢測平臺GPL17021，使用Illumina HiSeq 2500(Mus musculus)進行測序，利用R語言工具包edgeR和DEseq2對表達矩陣進行歸一化分析，并進行差異分析，|log FC|＞0.80和P＜0.05。

二、蛋白質相互作用網絡構建

通過STRING（https://string-db.org/）將篩選到的差異基因進行蛋白質與蛋白質相互作用網絡驗證。限制物種為小鼠，所使用的參數閾值為中度可信數據：0.400，使用的相互作用類型包括7種（Textmining，Experiments，Databases，Co-expression，Neighborhood，Gene Fusion，Co-occurrence）。

三、差異基因的GO和KEGG富集分析

使用R軟件的clusterProfiler包和reactome（https://reactome.org/）對篩選的差異基因進行GO富集分析和通路富集分析；使用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov）對差異基因進行GO和KEGG通路富集分析。設置P<0.05，分析結果以氣泡圖展示。

四、核心差異基因分析

利用Cytoscape的Hub插件分析核心基因，限定物種為小鼠，獲取蛋白相互作用關系，并導入Cytoscape軟件繪制相互作用網絡。利用cytoHubba插件分析節點的大小和顏色表示Degree值的大小，節點越大，顏色越紅對應的Degree值越大。

結 果

一、陰莖海綿體內皮細胞高糖處理損傷芯片分析

GSE146078芯片中初始數據共檢測覆蓋了23282個基因，其中20296個基因表達矩陣滿足初篩要求（總計數counts>1，即至少在其中一個樣本有表達）。經過R語言工具包edgeR和DEseq2對表達矩陣進行歸一化分析，并進行差異分析，最終得到了17139個基因的表達數據。其中總的差異基因為367個，包含有150個上調以及217個下調基因（圖1）。

圖1 小鼠陰莖海綿體內皮細胞高糖處理損傷芯片分析的火山圖（A）和熱圖（B）

二、高糖處理后內皮細胞差異基因通路富集分析

通過STRING在線分析工具對差異基因進行蛋白質與蛋白質相互作用網絡驗證，最終得到的相互作用網中包含結點數據332個、邊界數505條、平均結點度為3.04、平均聚類系數0.415、期待的邊界數據為243（圖2）。

圖2 差異基因的蛋白質相互作用網絡分析

在此基礎上對差異基因進行GO富集分析，結果顯示差異基因的分子功能主要集中在細胞因子活性、趨化因子活性、受體信號轉導、受體調控活性等過程（圖3A）。細胞組分富集分析發現其主要在細胞外胞質空間、質膜蛋白復合物（圖3B）。生物學功能通路富集可以發現差異表達基因在炎癥反應通路極顯著的富集，如急性時相反應、急性炎癥應答、白細胞遷移、白細胞趨化以及促炎癥因子白介素-1的應答等。同時也有一些代謝調控通路發生變化，如活性氧的代謝過程、氮氧化物的合成過程等（圖3C）。進一步進行Reactome相互作用組的富集分析，則發現這些差異表達基因主要富集在DNA損傷過程，如DNA碎片化激活因子、凋亡誘導的DNA碎片化等（圖3D）。

圖3 差異基因的GO富集分析

KEGG通路富集分析結果如圖4所示，上調基因主要富集在細胞色素P450對異生物質（xenobiotics）的代謝、類固醇激素的合成、谷胱甘肽代謝、軍團菌病、藥物代謝-細胞色素P450、血清素能突觸、沙門氏菌感染、類風濕關節炎、藥物代謝、IL-17信號通路以及化學致癌作用（圖4）。下調基因富集結果顯示其與Hippo通路相關（圖5）。

圖4 上調表達差異基因的KEGG通路富集分析

圖5 下調表達差異基因的KEGG通路富集分析

三、高糖處理后內皮細胞核心差異基因分析

利用Cytoscape的Hub插件分析發現，高糖處理小鼠陰莖海綿體內皮細胞差異基因中有兩個關鍵基因群，圖6左側為炎癥應答為代表的免疫調控網絡（代表的細胞因子有上調表達基因Ccl19、Cxcl1、IL-6和下調表達基因Cxcl12；代表的轉錄因子有下調表達基因Sox9等），右側基因群為結合DNA的組蛋白家族可能在DNA損傷凋亡以及片段化時期發生的變化（代表有上調表達基因Hist1h4d）（圖6）。我們在差異基因中發現多個基因家族特征性表達，如鋅指蛋白Zscan4（Zinc finger and SCAN domain containing 4）家族的Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d；谷 胱 甘 肽S-轉 移 酶GSTA（Glutathione S-Transferase Alpha）家族Gsta1、Gsta3以及Gsta4；細胞色素P450家族成員CYP2D包括Cyp2d10、Cyp2d11、Cyp2d12、Cyp2d13、Cyp2d34、Cyp2d37-ps、Cyp2d40以及Cyp2d9；血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A,Saa）家 族Saa1、Saa2、Saa3，且Saa1、Saa2、Saa3均顯著上調表達（圖7）。核心差異基因中，Cxcl12、IL-6等已被證明參與ED進展[8,9]，Zscan4家族、GSTA家族及P450家族成員在內皮細胞中的功能作用均未見報道，而Saa家族成員被發現與內皮損傷、炎癥反應等相關疾病過程密切相關[10,11]，但其在DED中的作用目前尚未見報道。因此，本研究將對Saa家族成員與DED的關聯進行進一步分析。

圖6 高糖處理后內皮細胞通路核心差異基因分析

圖7 高糖處理后內皮細胞中

四、Saa家族相關蛋白質分析

Saa1-3均定位于細胞外，屬于分泌型蛋白質[12]。我們經過STRING（https://string-db.org/）搜索得到Saa家族相關蛋白質相互作用網絡，發現其與多個載脂蛋白或者脂相關蛋白有關聯。其中包括載脂蛋白Lcn2（Lipocalin-2）、血清類粘蛋白Orm2（Orosomucoid 2）、激素原轉化酶1抑制劑Pcsk1n（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 inhibitor）、氧磷脂酶1Pon1（Paraoxonase 1）及載脂蛋白（Apolipoprotein）家族多個成員Apoa1，Apoa2，Apoc3，Apoe（圖8）。

圖8 STRING分析Saa家族相關蛋白質相互作用網絡

五、Saa家族功能富集分析

GO分析結果顯示Saa家族基因的分子功能主要集中在包括脂酶活性，熱休克蛋白結合，脂蛋白顆粒結合，磷脂結合等過程（9A）。其生物學功能主要富集于甘油三脂的代謝，膽固醇代謝，膽固醇內流，脂解反應，脂蛋白代謝等過程（9B）。其細胞組分主要集中在極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白，細胞外胞質等（9C）。KEGG分析發現其主要參與PPAR信號通路以及膽固醇代謝（9D）。

討 論

ED在糖尿病患者中的發病率是普通人群的3~4倍，在診斷為糖尿病后的前10年，超過一半的男性確診為DED，為患者和其家庭帶來巨大痛苦[13]。然而，由于DED發病機制尚未闡明，臨床上缺乏針對該病的特效藥物以及有效的治療靶點。近年來，隨著微陣列和測序技術的快速發展，基因芯片數據分析已被廣泛應用于研究多種疾病的發生發展以及靶基因的篩選等。如，Chen等[14]分析3個包含子宮內膜異位癥組織和正常子宮內膜組織的微陣列數據集，發現上皮-間充質轉化在子宮內膜異位癥中具有重要作用；Xue等[15]生物信息學分析發現CDC45、GINS2、MCM2和PCNA可能與宮頸癌患者預后相關，可作為宮頸癌患者的潛在治療靶點。因此，篩選與DED相關的靶標基因，對于開發治療DED的靶標藥物具有重要意義。

圖9 Saa家族功能富集分析

研究表明，DED的發生和發展與陰莖海綿體內皮細胞受損密切相關[6]。因此，本研究通過模擬血糖紊亂病理狀況致使陰莖內皮細胞損傷的芯片數據，利用GPL17021檢測平臺篩選出正常組小鼠和高糖條件處理組小鼠之間的差異基因分析，共發現367個差異表達基因，對這些差異基因進行GO功能富集分析，結果顯示這些差異表達基因主要涉及急性炎癥答應、活性氧化的代謝、DNA損傷等生物學過程，與已報道的炎癥因子及活性氧參與DED的結果一致。如炎性細胞因子IL-6和IL-1β含量降低可以有效改善糖尿病大鼠勃起功能[16]；血漿IL-8（sIL-8）水平與男性不育和ED有密切聯系[17]；抑制大鼠海綿體中活性氧（ROS）的產生可以緩解ED進展[18]。KEGG分析結果顯示，上調基因富集通路在細胞色素P450對異生物質（xenobiotics）的代謝、類固醇激素的合成、類風濕關節炎、藥物代謝和IL-17信號通路等。其中IL-17信號通路與內皮細胞病理功能相關，如IL-17影響肺動脈內皮細胞的增殖，血管新生以及細胞黏附[19]；其它如類固醇激素對內皮細胞功能也有維持作用[20]。下調基因與Hippo通路相關，Hippo通路的關鍵因子如YAP能夠調控內皮細胞激活并參與血管炎癥反應[21]。

在高糖誘導陰莖海綿體內皮細胞損傷相關基因分析中發現，其核心差異網絡中包括多個細胞因子如Ccl19、Cxcl1、Cxcl12、IL-6等；轉錄因子Sox9等；及Zscan4家族、GSTA家族、Saa家族成員等。據報道，基因工程改造后表達Cxcl12的間充質干細胞改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠ED癥狀[8]；抑制IL-6可減輕神經保留性根治性前列腺切除術大鼠模型的勃起功能障礙[9]。本研究分析發現，Saa家族成員Saa1-3在高糖誘導的小鼠海綿體內皮細胞中均顯著上調表達，提示Saa家族可能在DED過程中具有重要作用。

Saa即血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A），是炎癥性載脂蛋白家族，定位于細胞外，是一種分泌型蛋白質，屬于急性期反應過程中血清蛋白的降解與調控基因群，可引起全身系統性炎癥[12,22]。大量研究證明，Saa家族在內皮損傷、炎癥反應等相關疾病過程具有重要作用，如，Saa能夠增強人頸動脈內皮細胞的遷移、增殖，并增加內皮細胞管腔形成[10]；IL-1β可以誘導人類冠狀動脈內皮細胞中Saa的表達，最終加速冠狀動脈粥樣硬化進程[11]等。然而，其與DED的關聯尚未見報道。本研究進一步分析發現，發現其與Lcn2、Orm2、Pcsk1n、Pon1及Apo家族成員等多個載脂或者脂相關蛋白質有關聯。GO和KEGG功能富集分析結果也顯示其主要集中于低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、細胞外胞質等，參與脂蛋白顆粒結合、脂解反應，膽固醇代謝、脂蛋白代謝等過程。據報道，脂質代謝的異常與ED存在密切關聯，脂質代謝混亂和氧化應激都是DED的獨立危險因素[23,24]。部分研究表明，Pon1活性的降低可能與ED的致病性有關，并且由于抗動脈粥樣硬化酶Pon1的活性降低，患者的動脈粥樣硬化發展可能更快[25]；Apoe缺失會引起小鼠海綿體鈣化，最終導致小鼠勃起功能障礙的發生[26]。而本研究分析結果顯示Saa家族與脂相關蛋白存在相互作用，提示Saa家族可能通過載脂或者脂相關蛋白質參與DED的發生和發展過程。

綜上所述，本研究通過生物信息學篩選發現正常組小鼠和高糖條件處理組小鼠之間的差異基因基因主要涉及急性炎癥答應、活性氧化的代謝過程、DNA損傷過程等生物學過程。核心差異基因中Saa1-3在高糖處理后小鼠陰莖海綿體內皮細胞中顯著上調表達，可能是DED過程中的重要基因，Saa1-3與多個載脂蛋白或者脂相關蛋白有關聯，并涉及脂解反應，膽固醇代謝、脂蛋白代謝等過程。這對我們揭示DED發病機制以及藥物靶點研究提供了重要的理論參考。然而，Saa家族對DED的發生和發展過程是否具有重要的作用，有待進一步的功能驗證。