甘薯黃烷酮3-羥化酶基因IbF3H的克隆和表達特性分析

宋天曉 蘇文瑾 劉意 饒莉萍 Soviguidi Deka Reine Judesse 楊新筍 朱國鵬

摘? 要：黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是黃酮類化合物合成途徑中的一個關鍵酶。本研究基于前期轉錄組數據，以‘福菜薯7-6葉片為材料成功克隆CDS序列長度為1107 bp的基因IbF3H，利用生物信息學分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列對比、蛋白系統進化樹、蛋白的二、三級結構、預測其跨膜結構和亞細胞定位，并利用qRT-PCR分析鹽旱脅迫處理下基因的表達特性。結果表明，該基因含有3個外顯子和2個內含子，編碼368個氨基酸，蛋白分子量為41.12 kDa，等電點為5.83。存在多種類型的啟動子順式作用元件，如光響應元件G-Box、ACE，干旱脅迫相關的MBS元件，與脫落酸激素響應相關的ABRE元件等。與其他植物的氨基酸序列相似性達到了80%以上，可見IbF3H的編碼區高度保守，且黃烷酮3-羥化酶在進化上具有較高的保守性。IbF3H蛋白含有非血紅素雙加氧酶結構域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能結構域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶結構域），屬于雙加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在細胞質中表達并且不具備跨膜結構。qRT-PCR研究結果表明，IbF3H基因并非組織特異性表達的基因，葉和莖表達量高于莖尖和根。模擬鹽脅迫處理后，IbF3H基因表達量呈現先下降后上升的趨勢;模擬干旱脅迫處理后，IbF3H基因表達量始終高于對照組，以響應逆境脅迫。本研究可為下一步探索IbF3H基因在調控甘薯類黃酮生物合成途徑和功能作用奠定基礎。

關鍵詞：甘薯;黃烷酮3-羥化酶基因;qRT-PCR;脅迫表達

中圖分類號：S531????? 文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of Sweetpotato Flavanone 3-Hy- droxylase Gene IbF3H

SONG Tianxiao1，2， SU Wenjin1， LIU Yi1，3， RAO Liping1，3， Soviguidi Deka Reine Judesse1，3， YANG Xinsun1*， ZHU Guopeng2

1. Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064， China; 2. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Plants of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 3. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China

Abstract： Flavanone 3-hydroxylase （F3H） is a key enzyme in the synthesis of flavonoids. In this study， based on previous transcriptome data， a 1107 bp IbF3H CDS sequence was successfully cloned from ‘Fucaishu 7-6 leaves， using bioinformatics to analyze sweetpotato F3H gene sequence characteristics， amino acid sequence comparison， protein phylogenetic tree， secondary and tertiary structure of protein， predicting transmembrane structure， subcellular localization， and using qRT-PCR methods to analysis gene expression characteristics under simulated salt and drought stress. The results showed that the gene contained 3 exons and 2 introns， encoding 368 amino acids， the protein molecular weight was 41.12 kDa， and the isoelectric point was 5.83. There were types of promoter cis-acting elements， such as light-responsive elements G-Box and ACE， MBS elements related to drought stress， ABRE elements related to abscisic acid hormone response， etc. The amino acid sequence similarity with other plants was more than 80%. It could be seen that the coding region of IbF3H was highly conserved， and the flavanone 3-hydroxylase was highly conservative in evolution. The IbF3H protein contained a non-heme dioxygenase domain （DIOX-N superfamily） and a typical F3H protein functional domain （2OG-FeⅡ-Oxy oxygenase domain） and belonged to the dioxygenase superfamily. IbF3H protein may be expressed in the cytoplasm and without a transmembrane structure. The qRT-PCR experiment showed that the IbF3H gene was not a tissue-specific expressed gene， and the expression level of leaves and stems was higher than that of stem tips and roots. After simulated salt stress treatment， IbF3H gene expression showed a trend of decreasing first and then increasing; after simulated drought stress treatment， IbF3H gene expression was always higher than the control group in response to adversity stress. This study could lay the foundation for the next step to explore the IbF3H gene in regulating the sweet potato flavonoid biosynthesis pathway and function.

Keywords： sweet potato; flavanone 3-hydroxylase gene; qRT-PCR; stress expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.004

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]屬于旋花科、甘薯屬的同源六倍體植物[1]，是重要的糧食、飼料、工業原料作物和新型的生物能源作物，且具有極高的營養保健價值[2]。

甘薯中的酚類化合物主要包括酚酸、花色苷和類黃酮3大類[3]。其中類黃酮是植物的次生代謝產物，廣泛分布于植物界并具有較強的生物活性[4]。研究表明黃酮類化合物對植物的生長、發育和繁殖尤為重要，也有利于維持人類健康[5-7]。黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是黃酮類化合物合成途徑中的一個關鍵酶，屬于依賴2-酮戊二酸的雙加氧酶家族[8-9]。F3H催化4，5，7′-黃烷酮C3位的羥基化合成二氫山奈素（dihydrokaempferol，DHK），二氫山奈素是合成黃酮醇、前花色素苷、花青素的重要前體物質，而編碼黃烷酮3-羥化酶的F3H基因也是調控植物體內類黃酮代謝物積累的關鍵功能基因[10]。在辣椒和菊花中F3H基因是花青素代謝和積累途徑的關鍵基因[11-12];阻斷擬南芥F3H基因表達可以降低黃酮及花色素含量[13]。目前，F3H基因在許多植物中已經被克隆和研究，比如龍眼[8]、百合[9]、苦蕎[14]等。就甘薯而言，黃元射等[15]克隆了紫薯‘渝紫7號中的黃烷酮3-羥化酶基因并分析其氨基酸序列和蛋白三維結構特征;Lalusin等[16]研究發現了甘薯F3H基因在紫色和黃色品種中不同組織部位均有表達，不同發育時期表達情況不同;Hou等[17]研究發現弱光條件下紫肉甘薯貯藏根中與花色苷生物合成有關的IbF3H的mRNA水平受到抑制。對于甘薯F3H基因的生物信息學分析、組織特異性表達、干旱和鹽脅迫處理下基因表達情況研究較少。本研究以此為切入點，以前期轉錄組數據庫為基礎，篩選出一個與類黃酮生物合成密切相關的基因F3H，以‘福菜薯7-6為實驗材料，克隆該基因，并將其命名為“IbF3H”。以生物信息學方法分析該基因的序列和蛋白結構特征，以qRT-PCR方法分析IbF3H基因在不同品種、不同組織及模擬鹽旱脅迫處理下基因的表達情況。以期為進一步解析IbF3H基因在調控甘薯類黃酮生物合成途徑和功能研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試甘薯品種為‘福菜薯7-6‘EC16和‘福菜薯18，均種植于湖北省農科院糧食作物研究所盆栽場。以成熟的‘福菜薯7-6葉片為材料進行基因克隆，取栽后20 d的‘福菜薯7-6和‘EC16的根、莖、莖尖、葉進行qRT-PCR分析，取樣時液氮速凍1h后置于–80 ℃冰箱保存備用。

將經胚性愈傷誘導形成的‘福菜薯18再生植株接種于MS固體培養基上，培養條件為：28 ℃，光照條件為2000～3000 lx，16 h光照，8 h黑暗。4周后，取30株長勢基本一致的植株，無菌水洗凈殘留培養基后，移至1/2的霍格蘭溶液中馴化培養3 d。馴化后的植株各取15株分別放入含有30% PEG 6000和200 mmol/L NaCl的1/2霍格蘭溶液中，分別模擬干旱和鹽脅迫處理。鹽脅迫處理0、1、6、12 h，干旱脅迫為0、1、6、12、24 h處理，每個處理設置3個重復。將處理后的植株液氮速凍，研磨成粉，置于–80 ℃冰箱保存，用于鹽脅迫和干旱脅迫處理后的qRT-PCR分析。

1.2? 方法

1.2.1? IbF3H基因的克隆? 利用全式金生物技術的通用植物總RNA提取試劑盒提取‘福菜薯7-6葉片總RNA，置于–80 ℃超低溫冰箱保存備用，使用TaKaRa的反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，–20 ℃保存備用。

基于轉錄組測序獲得的Gene ID在甘薯野生種基因組網站http：//sweetpatato.plantbiology. msu.edu/index.shtml中進行檢索，獲得該基因的CDS序列。利用Primer 5.0軟件在參考序列CDS序列兩端設計特異性引物，克隆獲得IbF3H基因。反應總體系為50 μL（表1）?？寺CR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

利用TaKaRa公司pMD?19-T載體構建IbF3H克隆載體。連接反應總體積為10 μL：pMD?19-T載體1 μL，反應液5 μL，IbF3H的PCR回收產物4 μL，16 ℃連接過夜。將連接產物轉化DH-5α感受態細胞，搖菌6～8 h。吸取200 μL轉化后的感受態細胞，將其均勻涂抹在含有氨芐霉素（Amp）的LB固體培養基上，37 ℃倒置培養過夜。挑選單克隆搖菌后進行陽性克隆檢測，反應總體系為25 μL（表2）。

挑選陽性菌液測序，利用DNAMAN V6.0軟件分析序列信息，將測序正確的菌液保存。被保存的陽性菌液進一步增殖，提取pMDTM19- T-IbF3H質粒。質粒PCR反應程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃復性35 s，72 ℃延伸90 s，35個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.2?? IbF3H生物信息學分析? 利用相關平臺或軟件對IbF3H基因進行生物信息學分析，相關生物信息學分析工具見表3。

1.2.3?? IbF3H基因的表達分析? ‘福菜薯7-6‘EC16和‘福菜薯18的RNA提取與cDNA反轉錄參照IbF3H基因克隆的方法。利用Primer 5.0軟件設計IbF3H基因的熒光定量特異性引物，以甘薯肌動蛋白β-Actin基因為內參基因，參照TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書（全式金生物技術），在熒光定量PCR儀（BIO-RAD）上進行擴增，每個反應3次重復。反應體系如表4所示，熒光定量PCR擴增條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，40個循環;溶解曲線設置為65 ℃ 5 s到95 ℃，增量為0.5 ℃。檢測IbF3H基因在不同品種、不同組織、不同處理條件下的表達狀況，利用2-ΔΔCT法計算出基因的相對表達量。

1.3? 數據處理

所有試驗數據利用Excel和SAS 8.1統計分析軟件進行單因素方差分析（ANOVA），采用Duncan法對處理之間以及同一處理隨時間變化的差異性進行多重比較分析。

2? 結果與分析

2.1? IbF3H基因的克隆

采用同源克隆的方法，以‘福菜薯7-6葉片RNA為模板，以參考基因組CDS序列設計引物，克隆得到IbF3H，其CDS長度為1107 bp（圖1）。

2.2? IbF3H基因的生物信息學分析

IbF3H預測的基因外顯子和內含子結構如圖2所示，含有3個外顯子和2個內含子。選取IbF3H基因上游1500 bp的序列范圍進行啟動子順式作用元件預測，結果顯示，啟動子范圍內存在多種類型的啟動子順式作用元件（圖3）：（1）光響應元件G-Box、ACE、TCCC-motif;（2）起始子和增強子元件TATA-box，CAAT-box;（3）干旱脅迫響應元件MBS;（4）植物激素響應元件，與脫落酸激素響應相關的ABRE元件;（5）蛋白代謝相關元件O2-site等。上述結果表明，IbF3H啟動子可能受光調控，其活性可能受到一些激素和非生物脅迫的調控。

IbF3H蛋白編碼368個氨基酸，預測蛋白分子量為41.12 kDa，等電點為5.83。氨基酸序列對比結果顯示：甘薯IbF3H與其他物種F3H基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性，其中與蔦蘿、圓葉牽牛、高杯花、栽培茄子同源一致性分別為92.99%、92.45%、83.02%、82.75%，與其他植物的氨基酸序列相似性達到了80%以上（圖4）。除此之外，與其他品種甘薯的IbF3H1（GenBank登錄號為BAA75309.1）、IbF3H2（ANA53146.1）、IbF3H3（BAA75307.1）氨基酸序列對比一致性分別達到了98.92%、97.04%、96.23%，可見IbF3H蛋白的編碼區高度保守，從而進一步證明所克隆的基因確為甘薯F3H基因。

系統進化樹分析表明，甘薯IbF3H蛋白與蔦蘿、圓葉牽牛的關系較近，與枸杞、黑果枸杞等的親緣關系較遠（圖5）。

通過PredictProtein平臺在線預測結果顯示IbF3H蛋白二級結構中有56.79%的無規則卷曲（Random coil）、28.26%的α螺旋（Alpha helix），14.95%的β-折疊（β-sheet）結構構成。可能在第65、170、191、206個氨基酸處存在二硫鍵。預測結果顯示，IbF3H蛋白中可能含有cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-肉豆蔻?；稽c、酰胺化位點、ATP/GTP結合位點motif A（P環）等功能位點。通過SMART蛋白結構域數據庫預測可知，IbF3H蛋白含有非血紅素雙加氧酶結構域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能結構域（2OG- FeⅡ-Oxy加氧酶結構域），屬于雙加氧酶超家族。

通過TMpred在線軟件預測表明，IbF3H蛋白可能不具備跨膜結構（圖6）。亞細胞定位預測IbF3H蛋白可能在細胞質中表達。IbF3H蛋白三維結構預測如圖7所示，有30.27%的氨基酸與模板蛋白氨基酸相一致，達到了建模的要求（>30%），有36%的相似氨基酸序列結構與模板蛋白覆蓋率達到了92%。

2.3? IbF3H基因的表達特性分析

qRT-PCR結果表明（圖8），對于甘薯‘福菜薯7-6品種，IbF3H在莖中表達量顯著高于莖尖;在‘EC16中，葉的表達量極顯著高于根部;IbF3H在甘薯多個組織中均有表達，說明IbF3H并非組織特異性表達的基因。相對而言，葉和莖表達量高于莖尖和根，這可能與甘薯黃烷酮3-羥化酶在不同部位合成和作用有關。

利用200 mmol/L NaCl和30% PEG6000模擬鹽脅迫和干旱脅迫處理（圖9），IbF3H對NaCl響應是先降低后升高的趨勢，在1 h和6 h表達量低于對照組，在12 h表達量高于對照組;在對PEG6000的響應中，處理組一直高于對照，并在24 h時表達量達到最高，極顯著高于1、6、12 h。推測IbF3H在鹽脅迫和干旱脅迫處理后，參與類黃酮化合物合成，響應逆境脅迫。

3? 討論

隨著植物多酚化學和藥理學的發展，人們逐漸認識到多酚類次生代謝物質是具有獨特生理活性和藥理活性的天然產物[18]。F3H基因作為核心類黃酮——花青素途徑的關鍵結構基因之一[19]，越來越受到人們的關注。本研究以‘福菜薯7-6甘薯葉片cDNA為模板，成功克隆出IbF3H基因，其CDS序列為1107 bp，與黃元射等[15]克隆的‘渝紫薯7號F3H基因序列長度一致，與前人在檸條錦雞兒[20]、百合[9]、苦蕎[14]等其他植物上研究相接近。該基因含有3個外顯子和2個內含子，編碼368個氨基酸，蛋白分子量為41.12 kDa，等電點為5.83。與其他植物的氨基酸序列相似性達到了80%以上，其中與蔦蘿、圓葉牽牛等相似度較高，達到了90%以上。蛋白序列系統進化分析表明，甘薯IbF3H與蔦蘿、圓葉牽牛等旋花科植物親緣關系較近，可見IbF3H的編碼區高度保守，且黃烷酮3-羥化酶在進化上具有較高的保守性。IbF3H蛋白二級結構預測顯示含有非血紅素雙加氧酶結構域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能結構域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶結構域），屬于雙加氧酶超家族。與王海竹等[21]關于醋栗F3H的研究結果一致。預測結果顯示IbF3H蛋白可能不具備跨膜結構，并在細胞質中表達，與曹芳芳[22]關于F3H基因總結的規律類似。干旱脅迫下，紅砂F3H酶活性隨著干旱脅迫處理時間的延長，先升高后降低至處理前水平[23]。枸杞F3H基因的過表達提高了轉基因煙草對干旱脅迫的耐受性，提高了轉基因煙草的抗氧化酶和黃酮-3-醇的含量[24]。鹽脅迫下，不同濃度的鹽脅迫均能不同程度地提高枳實生苗中F3H基因的上調表達，進行脅迫響應[25]。過表達茶樹F3H基因，可增強轉基因煙草的耐鹽性[26]。低溫、高鹽、干旱和高溫脅迫均能誘導檸條F3H基因的表達，推測檸條F3H基因參與了非生物脅迫應答[27]。由此可見，當植物受到逆境脅迫時，F3H促進花青素的積累，增強抗氧化能力，從而抵御逆境。qRT-PCR結果表明，IbF3H基因并非組織特異性表達的基因，葉和莖表達量高于莖尖和根，這與張星等[9]、胡曉婧等[10]在百合和茶樹中關于LhSorF3H并非組織特異性表達的基因、CsF3H在葉中表達量較高觀點一致;模擬鹽旱脅迫處理后，IbF3H基因表達量在NaCl脅迫響應中呈現先降低后升高的趨勢，在30% PEG6000脅迫響應中表達量一直高于對照組，以響應逆境脅迫。與鄭晟等[20]、侯伶俐等[28]在檸條錦雞兒、苦蕎等植物中鹽旱模擬處理下F3H基因表達量變化趨勢相似。

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責任編輯：黃東杰