龍眼miRNA合成途徑相關基因的鑒定及表達分析

霍雯 陳曉慧 徐小萍 申序 李曉斐 賴鐘雄

摘? 要：為了解龍眼miRNA合成途徑相關基因的生物學功能，本研究依據龍眼第3代基因組數據對龍眼miRNA合成途徑相關基因進行了鑒定和生物信息學分析，并利用龍眼轉錄組對其在體胚發生早期定量表達進行分析。研究結果如下：共鑒定到12條龍眼miRNA合成途徑相關基因，分別是DlDDL1、DlDDL2、DlDDL3、DlDCL1、DlSE、DlHYL1a、DlHYL1b、DlHYL1c、DlCBP20、DlCBP80、DlHEN1、DlHASTY。這些基因編碼的氨基酸數目400～1000 aa，蛋白分子質量23.92～220.25 kDa;大部分蛋白均為酸性蛋白，所有蛋白均為不穩定蛋白，除DlHASTY外，其余蛋白均為親水性蛋白;基因結構分析表明，各成員內含子數目差別較大，為2～23個;所有成員均含有保守結構域，數目差別較大，為1～7個;啟動子順式原件分析顯示，基因啟動子區域均含有大量光反應元件及激素響應元件;蛋白互作預測分析顯示龍眼miRNA合成途徑相關基因具有較強的互作關系。對龍眼體胚發生早期過程中表達分析顯示，各基因在EC階段具有較高的轉錄水平。本研究表明：龍眼miRNA合成途徑相關基因可能參與龍眼體胚發育早期進程且在EC階段發揮重要作用，同時響應多種激素應答及非生物脅迫，推測其在生物學功能方面具有多樣性和差異性。

關鍵詞：龍眼;miRNA合成途徑相關基因;生物信息學分析;qPCR分析

中圖分類號：S667.2????? 文獻標識碼：A

Identification and Expression Analysis of Genes Related to Longan miRNA Synthesis

HUO Wen， CHEN Xiaohui， XU Xiaoping， SHEN Xu， LI Xiaofei， LAI Zhongxiong

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： In order to understand the biological functions of genes related to the longan miRNA synthesis pathway， we identified and analyzed the miRNA synthesis pathway-related genes in the third-generation genomic data of longan. And longan transcriptomes in the early stage of somatic embryogenesis （SE） was used for miRNA synthesis pathway-related genes expression analysis. A total of 12 genes related to longan miRNA synthesis pathway were identified， namely DlDDL1， DlDDL2， DlDDL3， DlDCL1， DlSE， DlHYL1a， DlHYL1b， DlHYL1c， DlCBP20， DlCBP80， DlHEN1， DlHASTY. The number of amino acids encoded by these genes was mostly between 400-1000 aa， and the molecular weight of the protein was 23.92-220.25 kDa. Most proteins were acidic proteins， all the proteins were unstable proteins. Except DlHASTY which is hydrophobic protein， the others were hydrophilic proteins. Gene structure analysis showed that the number of introns of each member varied greatly from 2 to 23. All members contained conservative domains， and the number difference varied from 1 to 7. Analysis of cis-acting elements in the promoter regions of gens related to miRNA synthesis pathway showed that a large number of light-responsive elements and hormone-responsive elements were presented in the promoter region of these genes. Protein interaction prediction analysis showed that the longan miRNA synthesis pathway-related genes had strong interaction relationship. Analysis of expression during the early stage of SE in longan showed that each gene had a high level of transcription at the EC stage. This study indicates that the genes related to the longan miRNA synthesis pathway may participate in the early development of longan SE development and play an important role in the EC stage， as well as responding to multiple hormone responses and abiotic stresses. Moreover， it is suggested that miRNA synthesis pathway-related genes might have diversity and differences in biological functions.

Keywords： longan; miRNA synthesis pathway-related genes; bioinformatics analysis; qPCR analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.001

MicroRNA（miRNA）是一類長度約為21～24 nt的內源性非編碼的單鏈負調控因子，主要在轉錄水平上通過介導基因的甲基化或在轉錄后水平上通過介導靶基因的降解等調節植物基因的表達。研究表明，在低等植物和高等植物中普遍存在很多miRNA家族，并且在進化過程很保守，這些miRNA的功能幾乎涉及到生長發育、信號轉導以及環境響應等生命進程的各個方面[1-3]。miRNA在植物體細胞胚發生過程中同樣起著很重要的調控作用，在玉米[4]、柑橘[5]、龍眼[6]等中均有相關研究。

植物miRNA的生物合成大致可以分為3個步驟，首先在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄成初級轉錄本（pri-mi RNA），pri-miRNA是含有一個或多個非完全互補的發卡結構[7];然后由DCLl （Dicer-like 1）切割pri-miRNA形成莖環狀前體miRNA（pre-miRNA），并在DCL1酶和RNA結合蛋白HYL1（Hyponastic Leavas 1）及C2H2鋅指蛋白SE（Serrate）的作用下形成miRNA：miRNA*雙鏈復合物[8];接著，由HUA ENHANCER 1（HEN1）甲基轉移酶對雙鏈結構3'端堿基進行甲基化，在HASTY蛋白協助下由細胞核運至細胞質;成熟 miRNA的一條鏈在細胞質中被降解，另一條成熟的miRNA進入RNA誘導的基因沉默復合物RISC（RNA-induced silencing complex）中發揮作用[9]。越來越多研究表明miRNA生物合成過程除了需要以上蛋白參與外，還需要許多蛋白因子的協同作用來共同調控miRNA的產生，SE蛋白與帽子蛋白CBP20（cap binding protein 20）和CDP80（cap binding protein 80）在pri- miRNA剪切過程中相互作用發揮著重要功能;在擬南芥中除DCL1、HYL1、SE外還發現了一種DDL（dawdle）蛋白也參與miRNA合成過程，在缺少DDL的突變體中發現pri-miRNA和成熟miRNA的積累減少[10]。

龍眼是我國重要的熱帶木本植物，其果實大小、產量及品質與胚胎發育過程有著密切的聯系[11]。本實驗室已經對龍眼體胚發育內在分子及基因調控機制開展了大量的研究，發現miRNA在龍眼體胚發生中具有重要作用[12-13]，但關于龍眼miRNA合成途徑基因的研究還未見報道。因此本實驗通過對龍眼miRNA合成途徑基因的鑒定及其理化性質、染色體分布、基因結構、蛋白保守結構域、系統進化樹、啟動子中順式作用元件進行分析，以及各基因在體胚發生早期不同階段特異表達FPKM分析，旨在了解龍眼miRNA合成途徑相關基因可能存在的生物學功能，為龍眼體胚發生過程的分子機制提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

采用在本實驗室已發表的第2代基因組數據基礎上重新進行3代測序精確組裝的龍眼基因組及轉錄組數據庫（待發表），第3代龍眼基因組測序平臺為PacBio Sequel，最終確定龍眼基因組染色體長度為0.45 Gb，Contigs N50=4.4 Mb，Super scaffold N50=27.7 Mb，Contig長度錨定率91.69%，Contig數量錨定率38.61%。擬南芥序列下載于TAIR-Home Page（https：//www.arabidopsis. org/），其余物種如水稻、甜橙、楊樹等氨基酸序列及基因序列下載于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

實驗材料為福建農林大學園藝植物生物工程研究所誘導并長期繼代的龍眼品種‘紅核子松散型胚性愈傷組織（LC2細胞系），并參照賴鐘雄的培養方法獲得胚性愈傷組織（embrogenic cultures，EC），不完全胚性緊實結構ICpEC（incomplete compact pro-embrogenic cultures，ICpEC），球形胚（globular embryos，GE）3個階段的胚性培養物，提取RNA后進行反轉錄用于熒光定量PCR反應[14]。

1.2? 方法

1.2.1? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因的鑒定及蛋白理化性質分析? 在TAIR網站下載模式植物擬南芥miRNA合成途徑相關基因的氨基酸序列AtDDL（AT3G20550.1）、AtDCL1（AT1G 01040.1）、AtSE（AT2G27100.1）、AtHYL1（AT1G 09700.1）、AtCBP20（AT5G44200.1）、AtCBP80（AT2G13540.1）、AtHEN1（AT4G20910.1）、AtHASTY（AT3G05040.1）為種子序列，經與龍眼基因組數據庫同源比對，篩選獲得具有完整Open Reading Frame（ORF）的龍眼miRNA合成途徑相關基因的候選序列，根據基因組注釋，采用DNAMAN 6.0軟件對候選的基因組DNA序列（genomic DNA，gDNA）、編碼序列（coding sequence）CDS進行分析和對比，結合NCBI Blast同源比對分析，然后根據在線網站Pfam（https：// pfam.xfam.org/）、NCBI Conserved Domain Search（https//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）以及HMMER （https：//www.ebi.ac.uk/Tools/ hmm）對龍眼miRNA合成途徑相關候選基因的蛋白結構域進行篩選，最終確定了12條相關基因。

根據龍眼基因組中的查找注釋，參考模式植物擬南芥和水稻的命名方法對得到的12條龍眼基因進行命名。通過ExPASy（https：//web.expasy. org/protparam）在線網站對上述12條基因的蛋白理化性質如氨基酸數目、相對分子量、等電點、不穩定系數以及親水性指數等方面進行分析。

1.2.2? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因結構與蛋白結構域分析? 采用工具TBtools[15]并利用龍眼gff及genome文件對獲得的12條基因序列進行外顯子和內含子特征分析;利用Pfam、CDD、HMMER等在線網站進行基因蛋白結構域的預測，并通過TBtools進行圖片可視化繪制。

1.2.3? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因進化樹構建? 通過NCBI下載其他物種相關基因的蛋白序列，最后采用MEGA軟件中的鄰近法（Neighbor-joining method）對龍眼及下載的蛋白序列進行系統進化樹構建，自展系數法（Bootstrap）設置為1000次重復檢驗。

1.2.4? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因啟動子分析? 經龍眼基因組數據庫提取獲得12條基因ATG上游2000 bp的序列，采用在線網站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）預測分析其啟動子特征和順勢作用元件功能，采用TBtools進行圖片可視化繪制。

1.2.5? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因蛋白互作預測分析? 利用在線網站STRING（https：//string-db.org）進行蛋白質互作預測，選用研究最深入的擬南芥作為參考，探究龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因蛋白之間的互作情況。

1.2.6? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因不同階段特異性表達分析? 通過龍眼轉錄組數據庫提取miRNA合成途徑相關基因在不同體胚發生階段：EC，ICpEC和GE特異表達的FPKM值，利用TBtools繪制表達熱圖，分析各基因在不同階段的表達情況。

1.2.7? 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析? 提取篩選得到的12條基因CDS序列，通過DANMAN結合引物設計原則設計12對符合條件的引物（表1）;參照Lin等[16]的具體操作步驟，采用20 μL反應體系進行熒光定量PCR測定;通過羅氏LightCyclers480熒光定量PCR儀，以EF-1a為內參基因，采用2-ΔΔCT計算龍眼miRNA合成途徑相關基因在體胚發生早期中的表達情況;利用Graphpad Prism 7進行作圖，并與其FPKM值進行分析比較。

2? 結果與分析

2.1? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因的鑒定及蛋白理化性質分析

首先從TAIR網站上下載擬南芥miRNA合成途徑相關基因編碼蛋白的氨基酸序列：經過龍眼第3代基因組數據庫的比對以及NCBI Blast雙向比對結果，再結合Pfam、HMMER、CDD等網站進行結構域預測，最后鑒定出12條龍眼miRNA合成途徑相關基因。最后參照模式植物擬南芥、水稻的命名方式將其命名為DlDDL1、DlDDL2、DlDDL3、DlDCL1、DlSE、DlHYL1a、DlHYL1b、DlHYL1c、DlCBP20、DlCBP80、DlHEN1、DlHASTY。

通過蛋白質特性分析可以發現（表2），miRNA合成途徑相關基因編碼的蛋白在400～ 1000 aa之間變化，蛋白分子質量23.92～220.25 kDa，其中DlHTL1b氨基酸數目最長為1968 aa，DlCBP20最短為206 aa;等電點5.05～10.32，大部分為酸性蛋白;不穩定系數45.20～103.43，均為不穩定蛋白;DlHASTY親水性指數為0.049，是疏水性蛋白，而其余蛋白親水性指數為–1.529～ –0.131，為親水性蛋白。

2.2? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因結構及蛋白結構分析

為了進一步了解龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因的結構特征，對12條基因的外顯子-內含子的結構進行研究，發現其表現出不同的外顯子-內含子的組織模式（圖1）。基因長度存在著明顯的差異，這很可能是因為在功能上的不同導致的。大部分基因的外顯子數量為10～20個，DlDDL的3個成員中DlDDL2的外顯子數目最少，僅有2個，DlDDL1和DlDDL3分別含有8和10個外顯子;DlDCL1、DlCBP80、DlHASTY的外顯子數目較多，均在20個左右，但DlCBP20的外顯子數目較少為7個;DlHYL1的1a、1c兩個成員外顯子數目較為一致相差不大，1b的外顯子數量僅為2個。12條基因呈現出不同的外顯子–內含子數量分布，這可能與基因功能的分化有關。

蛋白保守結構域的結果顯示（圖2）：DlDDL三個成員均含有典型的FHA結構域，但DlDDL1蛋白結構域的位置和長度均與DlDDL2、DlDDL3存在差異，推測它們在功能上可能有著不同的分工;DlDCL1顯示含有7個不同的蛋白結構域，其中包括典型的Dicer與PAZ結構域，且在不同植物中高度保守;DlSE顯示含有DUF3546和ARS2兩個結構域;DlHYL1的3個成員中DlHYL1a和DlHYL1b均含有2個dsrm結構域，DlHYL1c則含有3個;DlCBP20和DlCBP80的結構域不相同，DlCBP20只含有1個典型的RRM結構域且長度較長;DlHEN1顯示含有2個蛋白結構域，分別為DSRM和baccter_Hen1;DlHASTY只含有1個蛋白結構域Xpo1。

2.3? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因進化樹構建

為了進一步了解龍眼miRNA合成途徑相關基因的進化關系，在NCBI上下載不同物種相關基因編碼蛋白的氨基酸序列，并采用MEGA構建系統發育進化樹。結果顯示（圖3）：DlDDL1與甜橙的DDL蛋白親緣關系最近，DlDDL2、DlDDL3分別與擬南芥和楊樹DDL蛋白親緣關系較近;DlDCL1與甜橙親緣關系最為接近;DlSE蛋白與木槿、擬南芥在進化上保持較近的親緣關系，與甜橙、楊樹等親緣關系較遠;DlHYL1b、DlHYL1c與DlHYL1a不同，分別與擬南芥、油松親緣關系較近;DlCBP 20和DlCBP80在進化關系上都與水稻在親緣關系上保持較遠的距離;DlHEN1與橡膠樹、川桑親緣關系較近;DlHASTY與油松等親緣關系較遠。

2.4? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因啟動子分析

為進一步了解龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因5端調控序列的功能，通過PlantCARE在線對12條基因起始密碼子ATG上游2000 bp序列進行順式作用元件預測，預測分析結果表明（圖4）：12條基因均含有CAAT-box和TATA-box表明其都能夠進行正常的轉錄，但各基因的CAAT-box和TATA-box的數量多少有明顯差異。對各基因含有的順式作用元件進行分析發現（圖5），12條基因均含有大量的光學響應元件及少量的厭氧誘導響應元件，50%的基因都含有生長素、乙烯、茉莉酸甲酯、水楊酸等激素響應元件，75%的基因響應脫落酸和赤霉素應答;另外，還有一些基因含有與細胞周期、晝夜控制、干旱、脅迫、胚乳、分生組織、低溫等作用元件，提示這些基因可能參與生物鐘、抗旱抗寒、種子生長、胚胎發育等過程。不同基因所含有的順式作用元件以及數量都有差異，推測其對不同的脅迫響應具有一定的差異，并可能在龍眼生長發育中承擔著不同的特異性功能。

2.5? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因蛋白互作預測分析

利用String蛋白互作在線數據庫對龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因蛋白之間的功能關系進行預測，選擇研究較為深入的模式植物擬南芥作為參考，蛋白互作預測結果分析顯示（圖6）：miRNA合成途徑相關基因DCL1、SE、HASTY、DDL、HEN1、HYL1之間有很強的互作關系。

2.6? 龍眼體胚發生早期miRNA合成途徑相關基因不同階段FPKM值分析

為了進一步了解miRNA合成途徑相關基因在龍眼體細胞胚胎發生中的功能特點，結合龍眼第3代轉錄組數據庫中EC、ICpEC、GE 3個階段的FPKM值制作熱圖。結果顯示（圖7）：在3個不同階段中，除DlHYL1c表達量很低，其他基因的表達量相對較高，其中DlCBP20的表達量最高。DlDDL在3個階段的表達量比較平穩，且DlDDL1的表達量較高;DlDCL1和DlSE在3個階段中呈現出先上調后下調的模式;DlHYL1a與DlHYL1b表達模式一致呈現出下調模式;DlCBP20與DlCBP80、DlHEN1呈現出下調模式;DlHASTY則呈現出先上調后下調的表達模式。總體上，miRNA合成途徑相關基因在龍眼體細胞早期發育過程中呈現出不同階段的表達模式，提示不同基因在不同的體胚發生階段有著不同的功能特點。

2.7? 龍眼體胚發生早期不同階段miRNA合成途徑相關基因的表達模式分析

通過實時熒光定量PCR結果發現（圖8），DlDDL1與DlHYL1b幾乎不表達，DlDDL2、DlDDL3在體胚早期3個階段表達量較平穩;DlSE在體胚早期3個階段的表達量也較平穩;DlHYL1a在3個階段的表達量呈現明顯的下降趨勢，DlHYL1c在3個階段的相對表達量呈現先下降后上升的趨勢，但總體上仍是呈現下降趨勢;DlCBP20與DlCBP80的相對表達量總體上也是呈現下降趨勢，DlHEN1與DlHASTY的相對表達量趨勢與其FPKM值的趨勢大致相同均呈現下降趨勢。由此可見，miRNA合成途徑基因在龍眼體胚發生早期的表達程度有所不同，總體上在EC階段的表達量較高。

3? 討論

3.1? miRNA合成途徑相關基因在植物生長發育中的作用

miRNA合成途徑涉及到很多基因的參與，這些基因已經在模式植物尤其是擬南芥中展開廣泛研究。AtDDLs在miRNA的生物合成和內源性的siRNA中發揮作用，其突變體普遍呈現出發育過程延遲、生長分化出不完全的根、幼苗和花、結實率降低等現象，充分表明了DDL蛋白在植物早期生長發育過程中具有重要作用[17];HYL1又被稱為DRB1，是擬南芥中發現最早、研究最透徹的雙鏈RNA結合蛋白，擬南芥hyl1的突變體會出現如植株矮小、晚花、根系生長慢、根向地性減弱等發育缺陷的癥狀，同時還會出現對IAA不敏感并且抑制生長素運輸的現象，因此HYL1在植物的生長發育過程發揮著重要作用[18];有研究表明當在體外共孵育DCL1、HYL1、SE蛋白及pri-miR167時，能較精準地剪切出成熟miR167序列，若只加HYL1或SE蛋白其中一種時，剪切精確度會下降，若2種蛋白都不加時，剪切精確度下降更明顯，這說明HYL1和SE在DCL1識別pri-miRNA并剪切的過程中發揮重要作用[19];在水稻中發現CBP20蛋白可提高大腸桿菌重組對高鹽度、高熱和脫水的耐受性，提示OSCBP20蛋白在應激條件下可能起保護作用[20]，擬南芥中有研究發現CBP20和CBP80突變體中miRNA含量減少，pri-miRNA含量增多，免疫共沉淀實驗表明，pri-miRNAs 159、166、168和172可能與CBP20和CBP80有關，還發現ABA處理后的CBP20/80突變體種子中miR159積累減少，MYB33和MYB101轉錄水平的升高，推測CBP20和CBP80是ABA在種子萌發過程中誘導miR159所必需的[21];在擬南芥發育的大多數階段，HEN1的單個突變體表現出多種表型，如器官大小減少、蓮座葉形狀改變和花序數量增加[22];HASTY蛋白的缺失也會影響擬南芥發育中的許多過程，除減少莖根和側器官的大小外，還會影響莖尖分生組織的大小，延遲短時間內的花誘導，葉片和心皮的正面化，破壞花序的節性，降低生育能力等[23]。

3.2? miRNA合成途徑相關基因可能參與激素應答和響應非生物脅迫

miRNA合成途徑基因的表達不僅受到不同激素的誘導同樣也受到許多環境因子的調節，不同的基因對非生物脅迫的應答模式也有所不同。對龍眼miRNA合成途徑相關基因啟動子序列進行生物信息學分析發現，這些基因含有脫落酸、乙烯、赤霉素、生長素、茉莉酸甲酯、水楊酸的激素響應元件，脫落酸有調節胚的發育、加速脫落休眠及抑制生長的生理功能[24]，其中DlDCL1、DlCBP80、DlDRM2還有不止一個脫落酸激素元件;赤霉素不僅能促進體胚發生相關的轉錄因子表達影響早期胚性組織細胞向球形胚階段的分化[25]，還能影響胚軸的發育及種子的萌發[26];這些基因中還包含了水楊酸和茉莉酸甲酯的響應元件，這2種激素在植物抗病機制中發揮重要作用;生長素和乙烯對植物同樣有著很重要的作用，有研究發現這2種激素在棉花的體胚發育中有重要作用[27]，因此推測其中一些基因在相應的激素信號傳導中發揮一定作用。

3.3? miRNA及合成途徑相關基因參與植物體胚發育進程

植物體胚發生過程中需要很多基因的共同參與，其中miRNA及相關基因對植物體細胞胚胎的形成也有影響。在擬南芥中通過原位雜交實驗表明，HEN1可以通過miR167負調控ARF6和ARF8的表達進而調控胚珠發育[28]。

本研究通過對miRNA合成途徑相關基因在龍眼體胚發生早期的FPKM值與基因表達模式分析發現，DlDDL1與DlHYL1b在3個階段均不表達，而DlHYL1c在3個階段均有表達。DlDDL2、DlHYL1a、DlCBP20、DlHEN1、DlHASTY的表達模式與其FPKM值趨勢一致，其中DlHYL1a、DlCBP20、DlHEN1均呈現出下調的模式，在EC階段的表達量最高，提示其可能在龍眼胚性愈傷組織建成中發揮重要作用，DlDDL2、DlHASTY在3個階段的表達量相差不大;DlHYL1c、DlCBP80、DlHEN1的表達模式與其FPKM值相比雖略有差異，但總體均呈現出下降趨勢，即在EC階段的表達量最高;DlDDL3、DlSE的表達模式與其FPKM值相比也有差異，但在3個階段的表達趨勢均相對平穩。DlDCL1在3個階段的表達量呈現明顯的下降趨勢[29]。龍眼miRNA合成途徑相關基因在體胚發生早期3個階段的表達模式有差異，提示這些基因可能在龍眼體胚發生早期過程中發揮著不同的作用。

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責任編輯：黃東杰