戈寶麻中總黃酮含量測定方法優化工藝研究

蔣曉玲，李 飛，竇維佳，馬艷琳，姚 武＊

1.吉木乃海關，新疆阿勒泰 836500

2.阿勒泰海關，新疆阿勒泰 836500

戈寶麻，羅布麻夾竹桃科茶葉花屬作物，學名Apocynum Venetum L.，多年生野生草本韌皮纖維植物，在我國幾乎瀕臨滅絕，維吾爾語稱其為“克孜其干”，新疆人稱為“小花羅布麻”，在中國西北至東北十多個省均有零星分布，以新疆羅布泊西北方向興地峽谷和阿勒泰阿拉哈克鹽湖邊生長的為上品，在新疆阿勒泰地區因其特殊的生態環境及品質，由劉起堂更名為戈寶麻，其葉的總黃酮含量、氨基酸含量均很高，是《中國藥典》規定的最低標準的4～5倍。虞穎映等研究表明羅布麻茶在人體攝入量100倍范圍內對實驗動物的各項毒理學指標未產生毒理作用，可作為安全的天然植物茶，它具有降血壓、治療氣管炎、感冒的作用，還有抗輻射、抗衰老等功能。此外還可以用于治療抑郁和焦慮等疾病，和市面上的抗抑郁類藥物相比，有著治療效果好、毒副作用少、藥用成本低等優點，受到了廣泛關注，這也就擴大了戈寶麻的藥用范圍。總黃酮含量是評價羅布麻茶出口品質的一項重要指標，但是總黃酮含量測定在試劑過程中遇到了很多問題且操作比較復雜,如吸附劑粒度大小的問題、洗脫后溶液測定前放置時間的問題、乙醇濃度等問題。測定總黃酮含量有多種方法，包括液相色譜法、紫外區直接測定法、超聲提取法等。由新疆阿勒泰羅布麻有限公司生產的戈寶麻茶主要出口至日本和韓國等地區。我們對目前我國統一采用《保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊》（2003版）中的方法、前人所做方法及本實驗室前期制定的方法進行優化整合，建立了快速高效的測定方法，為進一步服務地方發展，保障出口戈寶麻茶的品質，加快企業的通關速度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品、主要試劑及儀器

戈寶麻茶（由新疆阿勒泰羅布麻有限公司提供）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）；石油醚（天津市富宇精細化工有限公司）；聚酰胺粉（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠出品）；甲醇（西安化學試劑廠）；聚酰胺層析柱（安捷倫）；粉碎儀（Retsch）；旋蒸儀（上海東璽制冷儀器設備有限公司）；超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；均質儀（德國Heidolph）；紫外分光光度計（ThermoFisherscientific）；水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2 標準曲線

參照《保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊》中總黃酮的測定配制標準液，繪制標準曲線。

1.3 方法

1.3.1 操作步驟

圖1 操作工藝圖

采樣方法參照GB/T8302進行，取樣用具和盛器應符合食品衛生有關規定，采取隨機取樣的方法采取相應量的戈寶麻茶，將戈寶麻茶樣品混合均勻，取適量用粉碎儀粉碎，置于取樣袋，備用。

1.3.2 不同乙醇濃度提取總黃酮

分別稱取0.5g粉碎后的戈寶麻茶于雞心瓶，第一組實驗加入50mL50%乙醇，第二組實驗加入50 mL 75%乙醇，第三組實驗加入50 mL80%乙醇，第四組實驗加入50mL90%乙醇搖勻，頻率53Khz60℃超聲波清洗器中超聲提取30min，過濾，取濾液0.5mL加入到含1g聚酰胺粉的蒸發皿中（濾液均勻分布），水浴83℃揮干乙醇，用漏斗轉移至聚酰胺層析柱中，25mL石油醚洗滌，吹干。用甲醇洗脫至聚酰胺粉為無色，收集洗脫液，旋蒸儀對洗脫液進行濃縮，用比色管定容至10mL。甲醇調零，于360nm紫外分光光度計下測定吸光度值。每個樣品分別設3個重復。

1.3.3 乙醇不同加入方式提取總黃酮

分別稱取0.5g粉碎后的戈寶麻于雞心瓶，第一組實驗用1.3.2確定的乙醇濃度定容至 50 mL，第二組實驗直接加入50mL相應濃度乙醇，其余步驟同1.3.2。每個樣品分別設3個重復。

1.3.4 不同蒸餾時間提取總黃酮

分別稱取0.5g粉碎后的戈寶麻于雞心瓶，用1.3.3確定的乙醇濃度及1.3.4確定的乙醇加入方式加入雞心瓶，搖勻，用83℃熱水回流1h、2h、3h、6h、8h。其余操作步驟同1.3.2。每個樣品分別設3個重復。

1.3.5 高溫振蕩提取總黃酮

分別稱取0.5g粉碎后的戈寶麻置于燒杯中，第一組實驗置于13000rpm/min均質儀中1 min，第二組實驗置于83℃水浴搖床振蕩30 min，第三組實驗置于13000rpm/min均質儀中1min后83℃水浴振蕩30min。其余操作步驟同1.3.2。每個樣品分別設3個重復。

1.3.6 回收率試驗

將已知濃度蘆丁標準液加入含1g聚酰胺粉的蒸發皿中（濾液均勻分布），水浴83℃揮干乙醇，用漏斗轉移至聚酰胺層析柱中，25mL石油醚洗滌，吹干。其余操作方法同1.3.2。

蘆丁回收率%=(實際測得蘆丁含量/理論上蘆丁含量)×100%

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準品標準曲線圖

按照1.2中方法對標準蘆丁溶液進行吸光度測定，以濃度對吸光度值做標準曲線，如圖2所示。線性回歸方程為Y＝0.0272X-0.0033，總黃酮含量（以蘆丁計）在0～25ug/mL范圍內，符合朗伯比爾定律，關系數0.2＜A＜0.8，線性關系良好。

圖2 蘆丁標準品標準曲線圖

2.2 乙醇濃度的確定

按照1.3.2測定不同乙醇濃度提取總黃酮所得量，于360nm波長下測定吸光度，計算所得結果如表1所示。結果顯示，戈寶麻采用75%乙醇作為提取液時，提取效率較高，采用t檢驗，P＜0.01，差異性極顯著。

表1 乙醇濃度試驗

2.3 乙醇加入方式的確定

按照1.3.4測定不同加入方式加入2.2確定的75%乙醇，計算結果如表2所示，定容至50 mL的提取效率高于直接加入50mL乙醇的提取效率，采用t檢驗，P＜0.01,差異性極顯著。

表2 乙醇加入方式試驗

2.4 蒸餾時間（加熱回流時間）

按照1.3.4測定不同加熱回流時間的總黃酮提取率，計算結果如表3所示，結果顯示6h后提取的總黃酮含量均值達3.92g/100g，采用t檢驗，分析加熱回流后的提取效果，P＜0.01，差異性極顯著。

表3 蒸餾時間試驗

2.5 高溫振蕩提取總黃酮

按照1.3.5中用13000rpm/min的均質儀及83℃搖床中總黃酮含量的測定，計算結果如表4所示。結果表明，1min均質儀后，于83℃水浴搖床中30 min總黃酮提取量均值為3.62 g/100g，采用t檢驗，兩兩分析結果表明，P＜0.01，差異性極顯著。

表4 高溫振蕩提取總黃酮

2.6 回收率

按1.3.6測得蘆丁平均回收率為102.03%。

3 討論

在我國中草藥植物發展的歷史長河中，羅布麻有著舉足輕重的地位，尤其在新疆，已在人們的日常生活中發揮著極為特殊的健康作用。與普通羅布麻相比，新變種阿勒泰戈寶麻無論在有效成份含量亦或是珍稀程度上，均堪稱上品。大量研究表明，羅布麻含有多種化學成分，包括黃酮類，糖苷類，甾醇類，酸類，氨基酸類，微量元素類（鈉、鈣、鎂、鐵、鉀、錳）等物質，其中黃酮類是其主要成分，含量在0.2%～2.5%。它可以降血壓、降血脂、抗抑郁、抗氧化等作用。目前我國規定的保健食品中總黃酮的測定主要采用紫外分光光度法和硝酸鋁顯色法2種方法，不同的測定方法對羅布麻同一材料的測定結果不完全相同，有時甚至可能會有較大差異。為了提高總黃酮提取量，有效評價出口戈寶麻茶的功效，我們采取了多種方法進行優化。

實驗結果表明，本實驗方法簡單快速，回收率為102.03%，利用本法提取得到的黃酮類物質純度較高。本實驗首先通過乙醇加入方式進行了比較，提取結果顯示定容加入乙醇的方式效果優于直接加入乙醇的方式，差異性極顯著，可能是由于直接加入乙醇的量大于定容乙醇的量，稀釋了戈寶麻茶中總黃酮的量。

通過比較本實驗室采用的75%乙醇提取總黃酮含量與前人使用的80%乙醇相比較，差異性顯著，75%乙醇提取效果優于80%，據文獻報道，黃酮物質高效液相色譜分析結果說明，水提取物中主要是蘆丁和綠原酸，50%醇提取物中主要是蘆丁和原兒茶酸，95%醇提取物種主要是蘆丁，從本實驗結果說明戈寶麻茶中總黃酮成分大多是脂溶性成分。

通過比較不同乙醇濃度及不同乙醇加入方式超聲波提取30min、加熱回流時間梯度及均質1min置于83℃搖床30min中比較總黃酮提取量，發現加熱回流時間6h和均質1min置于83℃搖床30min中效果較好，均值分別為3.92g/100g和3.62g/100g。出于用簡單、快速、高效的方法提取戈寶麻中總黃酮含量，加快企業通關速度，我們選擇后者作為黃酮測定的方法。對于隨著蒸餾時間的加長能否繼續提升黃酮提取含量，有待我們進一步研究。

采用75%乙醇作為提取液定容至50mL，均質1min置于83℃搖床30min中的方法與保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊的區別見表5。

表5 與保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊區別

4 結論

定容加入乙醇的方式總黃酮含量效果優于直接加入乙醇的方式。75%乙醇提取總黃酮含量的效果較好。本方法建議戈寶麻茶中總黃酮提取方法具有較好效果的處理條件為：一是采用75%乙醇作為提取液，定容至50mL，加熱回流時間6h；二是采用75%乙醇作為提取液定容至50mL，均質1min置于83℃搖床30min中效果較好。