黃芪多糖對小鼠慢性腎功能衰竭保護作用的機制研究

楊潔珂，王麗，于千惠，刁會，樊均明，2△

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）在世界范圍內已被視為重要公共衛生問題［1］。內皮細胞損傷、炎性細胞浸潤、毒素蓄積進一步加快了終末期腎 病（end-stage renal disease，ESRD）發 展 的 進程［2-3］。近年來，隨著“腸-腎軸”理論的提出，研究顯示腸道微生態與CKD之間存在密切聯系［4］。人體腸道由益生菌和機會致病菌維持著“動態平衡”［5］。研究發現，慢性腎功能衰竭患者中，尤其是ESRD患者，長期代謝蓄積體內的廢物，致血液內毒素濃度過高而透過腸壁血管進入腸腔，引起腸道微生態改變，導致菌群失調［6］。而失調的菌群又可導致腸道功能紊亂，蛋白質降解受阻，毒素蓄積，從而進一步加重CKD的進展［7］。與此同時，隨著測序技術的不斷發展，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的生物學功能受到關注。根據最新研究結果，lncRNA在CKD的發生發展中起著重要作用［8］。因此，探究lncRNA在“腸-腎軸”中的功能可能是一種新近治療思路。黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是傳統中藥黃芪中的主要成分之一，具有明確的抗炎、抗氧化、抗纖維化、調節菌群等作用［9-11］。但黃芪多糖是否在腸、腎發揮聯動調節作用仍未明確。本研究旨在從腸道微生態角度，探討黃芪多糖對慢性腎功能衰竭小鼠的保護作用，以闡明其可能的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物6～8周齡雄性健康Balb/c小鼠30只，體質量18～22 g，購于成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2015-030。將所有動物置于溫度和濕度受控的房間中飼養，溫度（21.0±2.0）℃，濕度（65±5）%，自由飲水，并保持12 h/12 h晝夜循環光照。所有動物實驗均根據西南醫科大學動物倫理委員會批準的指導原則進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 黃芪多糖（純度：HPLC＞95%；Macklin，A860847）。總RNA提取試劑盒（Tiangen，DP419）；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒KitHiScript?ⅢRT SuperMix（+gDNA wiper）（Vazyme，7E34219）；糞便基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，DP328）；肌酐（Scr）肌氨酸氧化酶法試劑盒（南京建成，C011-2-1）；尿素氮（BUN）脲酶法試劑盒（南京建成，C013-2-1）；尿蛋白定量（CBB法）測試盒（南京建成，C011-2-1）；鏈霉卵白素-生物素標記山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗（中杉金橋，SP-9001、SP-9002）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（Neobioscience，EMC102a、EMC001b、EMC004）；鼠抗鼠緊密連接蛋白-1（ZO-1、Claudin-1、Occludin-1）單 克 隆 抗 體（Life technologies，QG215365、QD215273、QH215846），小鼠抗鼠核因子κB（NF-κB）單克隆抗體（Bioss，bs-0465R）；兔抗鼠p-NF-κB單克隆抗體（CST，#3033）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天，A0208、A0216）二抗。ECL凝膠成像系統（BIO-RAD，USA）；Light Cycler?480II PCR儀（Roche，Swiss）；VS120虛 擬數字切片顯微鏡（Olympus，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 將30只小鼠適應性喂養1周后采用隨機數字表法分為假手術組、慢性腎功能衰竭模型組（模型組）和黃芪多糖干預組（APS組），每組10只。1%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）腹腔注射，無菌條件下分別沿后正中線左側0.5 cm，肋弓下緣0.5 cm處做手術切口，游離左側腎臟，模型組和APS組予以左腎切除并逐層縫合切口，假手術組只游離腎臟不切除并縫合切口。術后繼續正常喂養1周，將模型組和APS組予以右腎的上1/3和下1/3結扎，將右腎等分為腎上、中、下三部分并縫合切口，假手術組同樣只游離腎臟不結扎并縫合切口。術后正常喂養7周，隨后APS組給予APS 100 mg（/kg·d）灌胃，其余2組給予等體積生理鹽水連續灌胃。4周后行心臟取血并處死小鼠，處死前1 d各組小鼠置于代謝籠飼養，收集小鼠24 h尿液和糞便。處死后收集小鼠血清及右腎中部、結腸組織樣本，部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片；剩余部分凍存于-80℃冰箱進行后續分析。5/6腎切除模型造模期間，模型組死亡2只；灌胃期間模型組小鼠死亡2只，APS組死亡1只；小鼠出現死亡及時補充造模。

1.2.2 血清Scr、BUN、24 h尿蛋白定量檢測 心臟采血后于4℃靜置過夜，隨后3 000 r/min離心15 min吸取上層血清。準備好收集的血清、尿液按照操作說明書分別檢測血清Scr、BUN和24 h尿蛋白定量。

1.2.3 HE、天狼星紅染色 將切片置于65℃烤箱烘烤2 h，予以二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水。蘇木素滴染2 min，自來水沖洗；伊紅浸染1 min，自來水沖洗行HE染色。天狼星紅浸染2 h，自來水沖洗，蘇木素染核3 min，自來水沖洗行天狼星紅染色。脫水透明封片后置于光鏡下觀察腎臟和腸道的結構改變及腎臟纖維沉積情況。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測緊密連接蛋白-1家族及p-NF-κB表達水平 切片置于65℃烤箱烘烤2 h，予以二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水。予檸檬酸三鈉抗原修復，晾至室溫后滴加過氧化氫阻斷劑10 min，封閉液15 min，滴加鼠抗ZO-1、Claudin-1、Occludin-1一抗，兔抗p-NF-κB一抗（1∶150），4℃孵育過夜，分別滴加對應抗小鼠、抗兔二抗后常溫孵育1 h，DAB顯色劑顯色，蘇木素染核數秒，無水乙醇脫水，二甲苯透明。封片后置于光鏡下觀察免疫復合物沉積情況。

1.2.5 ELISA檢測IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平 收集小鼠血清，按試劑盒操作說明分別檢測各組IL-1β、IL-6和TNF-α細胞因子水平。

1.2.6 Western blot檢測緊密連接蛋白-1家族及p-NF-κB蛋白水平 各組取適量結腸及腎臟皮質樣本于RIPA蛋白裂解液和PMSF混合液中充分裂解30 min提取總蛋白，考馬斯亮藍法定量蛋白濃度，加Loading Buffer煮沸后取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離轉移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，加入相應的ZO-1、Claudin-1、Occludin-1、p-NF-κB、NF-κB（1∶1 000）、GAPDH（1∶50 000）一抗于4℃搖床過夜，次日TBST洗膜后加入帶HRP標記山羊抗兔、抗鼠二抗（1∶2 000）于室溫孵育1 h，滴加ECL發光液于Bio-rad凝膠成像系統成像。以Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白GAPDH的比值以及p-NF-κB與NF-κB的比值，進行定量分析。

1.2.7 總RNA及糞便基因組DNA的提取 各組取適量腎臟皮質樣本，在Trizol裂解液中充分裂解，按照RNA simple Total RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA，測RNA濃度，參照試劑盒說明書制備逆轉錄反應體系，將總RNA逆轉錄為cDNA。取適量新鮮糞便樣本根據糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取糞便DNA，測定樣品DNA濃度及A260/A280比值，比值在1.8左右為佳，否則重提。

1.2.8 qPCR檢測促炎細胞因子、糞便菌群的表達量 在LightCycler?480Ⅱ儀器上進行qPCR檢測腎臟組織中lncRNA Arid2-IR及促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達量，以GAPDH作為內參基因，通過比較循環閾值2-ΔΔCt分析結果。檢測糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌的表達量，采用細菌16 s rRNA V3區的擴增產物作為對照［12］，通過循環閾值2-ΔΔCt分析結果。整個擴增程序：95℃10 min預變性，40個循環（95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s）變性、退火、延伸；每個樣本均設置3次重復，基因引物及細菌引物序列見表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

Tab.1 The primer sequences of qPCR表1 qPCR所用引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8軟件對數據進行統計分析，數據均采用±s表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用One-way ANOVA，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APS對CKD小鼠腎功能的影響 與假手術組相比，模型組和APS組Scr、BUN和24 h尿蛋白總量均明顯升高，而APS組Scr、BUN和24 h尿蛋白較模型組均顯著下降（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of Scr,BUN and 24 h urine protein content between the three groups of mice表2各組小鼠Scr、BUN及24 h尿蛋白含量的比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of Scr,BUN and 24 h urine protein content between the three groups of mice表2各組小鼠Scr、BUN及24 h尿蛋白含量的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）24 h尿蛋白總量（mg/L）假手術組7.85±1.266.26±0.771.72±0.30模型組147.80±10.68a19.34±1.98a6.42±0.15a APS組59.70±5.15ab12.86±1.53ab4.54±0.37ab F528.532＊＊93.374＊＊201.827＊＊

2.2 APS對CKD小鼠腎臟和結腸病理損傷的影響 腎臟HE染色結果顯示，與假手術組相比，模型組腎小球明顯萎縮硬化，腎小管擴張明顯，伴隨腎小管上皮細胞壞死脫落；APS組腎小管上皮細胞凋亡減少，管腔擴張程度減輕，腎小球形態稍有恢復，見圖1。天狼星紅染色結果顯示，與假手術組相比，模型組染色陽性區域明顯，腎纖維化程度嚴重；而APS組纖維化程度明顯改善，見圖2。HE染色結果顯示，假手術組結腸黏膜上皮完整，絨毛排列整齊；模型組黏膜上皮脫落糜爛，絨毛縮短，數量減少，刷狀緣不連續，固有層水腫明顯，炎細胞浸潤，紅細胞增多；APS組絨毛高度有所恢復，刷狀緣連續性有所改善，炎細胞減少，腸黏膜損傷較模型組有明顯好轉，但仍存在水腫，見圖3。

Fig.1 The effect of APS on mouse kidney tissue structure(HE staining,×200)圖1 APS對小鼠腎臟組織結構的影響（HE染色，×200）

Fig.2 The effect of APS on kidney fiber deposition in mice(sirius red stain,×200)圖2 APS對小鼠腎臟纖維沉積的影響（天狼星紅染色，×200）

Fig.3 The effect of APS on the morphology of mouse colonic epithelium(HE staining,×200)圖3 APS對小鼠結腸上皮組織形態的影響（HE染色，×200）

Fig.4 The effect of APS on Claudin-1 expression in mouse colon tissues(immunohistochemical staining,×200)圖4 APS對小鼠結腸組織Claudin-1表達的影響（免疫組織化學染色，×200）

Fig.5 The effect of APS on Occludin-1 expression in mouse colon tissues(immunohistochemical staining,×200)圖5 APS對小鼠結腸組織Occludin-1表達的影響（免疫組織化學染色，×200）

Fig.6 The effect of APS on ZO-1 expression in mouse colon tissues(immunohistochemical staining,×200)圖6 APS對小鼠結腸組織ZO-1表達的影響（免疫組織化學染色，×200）

Fig.8 The effect of APS on the expression of p-NF-κB in mouse kidney tissues(immunohistochemical staining,×200)圖8 APS對小鼠腎臟組織p-NF-κB表達的影響（免疫組織化學染色，×200）

2.3 APS對CKD小鼠結腸組織緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin-1及ZO-1表達水平的影響 免疫組織化學染色結果顯示，假手術組小鼠結腸組織Claudin-1、Occludin-1、ZO-1蛋白均呈蜂窩狀或點狀聚集，并均勻分布在腸上皮細胞頂端，模型組3種蛋白零散且分布不均，APS組可見緊密連接蛋白表達有所恢復并均勻分布，見圖4～6。Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組與APS組結腸組織Claudin-1、Occludin-1、ZO-1蛋白表達明顯下降，而APS組3種蛋白的表達量較模型組明顯升高（P＜0.01），見圖7、表3。

Fig.7 Protein levels of Claudin-1,Occludin-1 and ZO-1 in mouse colon tissue of the 3 groups圖7 Western blot檢測3組小鼠結腸組織中Claudin-1、Occludin-1和ZO-1蛋白水平

Tab.3 Comparison of expression levels of Claudin-1,Occludin-1 and ZO-1 in colonic tissues of mice between the three groups表3各組小鼠結腸組織Claudin-1,Occludin-1及ZO-1蛋白的表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of Claudin-1,Occludin-1 and ZO-1 in colonic tissues of mice between the three groups表3各組小鼠結腸組織Claudin-1,Occludin-1及ZO-1蛋白的表達水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別Claudin-1Occludin-1ZO-1假手術組1.69±0.131.32±0.102.01±0.09模型組0.59±0.07a0.48±0.04a1.06±0.11a APS組0.87±0.13ab0.56±0.02ab1.44±0.15ab F 77.892＊＊177.000＊＊49.022＊＊

2.4 APS對CKD小鼠炎癥反應的影響qPCR結果顯示，與假手術組相比，模型組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平明顯升高，而APS組較模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達均明顯下降（P＜0.05），見表4。ELISA檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達顯著升高，而APS組較模型組IL-1β、IL-6、TNF-α表達下降（P＜0.05），見表5。

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in renal tissues of mice between the three groups表4各組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in renal tissues of mice between the three groups表4各組小鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α假手術組1.11±0.201.03±0.301.02±0.24模型組3.13±0.30a2.88±0.57a3.46±0.68a APS組2.07±0.21ab1.87±0.54ab2.42±0.31ab F 57.550＊＊10.910＊21.620＊＊

Tab.5 Comparison of the serum expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α between the three groups of mice表5各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.5 Comparison of the serum expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α between the three groups of mice表5各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α假手術組0.03±0.010.12±0.140.23±0.04模型組0.11±0.02a1.12±0.23a0.82±0.08a APS組0.07±0.01ab0.66±0.14ab0.54±0.05ab F 21.384＊＊24.943＊＊77.734＊＊

2.5 APS對腎臟組織NF-κB活化的影響 免疫組化結果顯示，與假手術相比，模型組腎小球及腎間質有大量p-NF-κB沉積，而APS組p-NF-κB沉積較模型組明顯減少，見圖8。Western blot結果顯示，假手術組、模型組和APS組p-NF-κB蛋白表達量分別為0.89±0.02、1.25±0.11和1.12±0.15，差異有統計學意義（n=10，F=8.671，P＜0.05）。與假手術組相比，模型組p-NF-κB蛋白表達明顯上升，而APS組p-NF-κB蛋白表達量較模型組明顯下降（P＜0.05），見圖9。

2.6 APS對腎臟組織lncRNA Arid2-IR的影響 腎臟組織qPCR結果顯示，假手術組、模型組和APS組lncRNA Arid2-IR表達水平分別為1.10±0.26、4.25±0.30和3.24±0.34（n=10，F=8.671，P＜0.01）。與假手術組相比，模型組中lncRNA Arid2-IR的表達明顯升高，而APS組中lncRNA Arid2-IR較模型組表達明顯下降（P＜0.05）。

Fig.9 Protein levels of p-NF-κB in mouse kidney cortex of the three groups圖9 Western blot檢測3組小鼠腎皮質中p-NF-κB蛋白水平

2.7 APS對腸道菌群的調節作用 小鼠糞便的qPCR結果顯示，與假手術組相比，模型組的大腸桿菌表達量明顯升高，乳酸桿菌、雙歧桿菌的表達量明顯下降（P＜0.05），而APS組乳酸桿菌、雙歧桿菌的表達量較模型組有所升高，大腸桿菌的表達量出現下降（P＜0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of expression levels of probiotics and opportunistic pathogens in feces of each group of mice表6各組小鼠糞便中益生菌及機會致病菌表達量的比較（n=10，±s）

Tab.6 Comparison of expression levels of probiotics and opportunistic pathogens in feces of each group of mice表6各組小鼠糞便中益生菌及機會致病菌表達量的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01，a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別 乳酸桿菌 雙歧桿菌 大腸桿菌假手術組1.01±0.211.00±0.141.01±0.19模型組0.18±0.03a0.09±0.02a10.76±1.81a APS組0.55±0.01ab0.43±0.13ab5.64±1.28ab F 34.452＊＊55.232＊＊43.166＊＊

3 討論

人體腸道內有成百上千種菌群，健康的菌群環境可參與腸壁保護、毒素代謝、免疫調節等，失調的菌群環境亦可誘發、加重腎臟疾病［5］。這與中醫認為慢性腎功能衰竭的基本病機為脾腎虧虛、濕濁內阻一致［13］。兩者互為因果，相互作用。

在前期研究中［14］，本課題組對我院臨床用于治療慢性腎病的中藥復方黃芪三七合劑干預治療5/6腎結扎誘導的慢性腎功能衰竭小鼠進行腸道菌群分析，發現腎功能衰竭小鼠細菌的類別發生了一定變化，其中有益菌雙歧桿菌、乳酸桿菌的菌群豐度顯著降低，但有害菌大腸桿菌的菌群豐度明顯升高，與文獻［15］報道相一致。研究表明，菌群失調可激活機體NF-κB，產生持續的炎癥反應，破壞腸道黏膜機械屏障完整性，導致毒素通過腸壁血管進入血液，進一步加重CKD患者腎臟負荷［16-18］。目前，已有研究證實lncRNA可參與介導CKD的發生發展，其中lncRNA np_28496啟動子區域包含了Smad3的結合位點，因其位于Arid2基因的內含子區域內，又稱lncRNA Arid2-IR。研究發現該lncRNA在單側輸尿管梗阻小鼠誘導的腎功能衰竭模型腎臟中高表達［19］。另有研究發現其可促進NF-κB介導的炎癥，NF-κB活化后可激活下游促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，本課題組前期在糖尿病腎病模型中得到同樣結論［20］。因此，通過介導lncRNA Arid2-IR“從腸治腎”也許是治療慢性腎病的新的方向。

本研究進一步探索了黃芪主成分APS對“腸-腎軸”的調節作用。血清Scr、BUN、24 h尿蛋白檢測結果顯示黃芪多糖治療可明顯改善腎功能衰竭小鼠的腎臟功能；HE染色及天狼星紅染色發現APS治療后腎功能衰竭小鼠腎臟及結腸的病理損傷、腎臟纖維沉積均得到了改善；ELISA檢測發現慢性腎功能衰竭模型組小鼠的炎性因子表達明顯升高，提示機體處于持續的全身炎癥狀態。與此同時，模型組腸道緊密連接蛋白家族中Claudin-1、Occludin-1和ZO-1的表達均明顯下降，而這些蛋白在維持腸道正常生理功能中起著重要作用，其表達量降低提示腸黏膜破壞嚴重，屏障功能受損［21］。經APS治療后，慢性腎功能衰竭小鼠腎組織中lncRNA Arid2-IR及p-NF-κB水平均明顯下調，炎性因子表達下降，而腸上皮緊密連接蛋白的表達增加。提示系統炎癥以及腸道屏障損傷均明顯改善，腸壁得到了修復，表明APS對慢性腎功能衰竭小鼠的結腸腸道屏障具有保護作用，且該作用可能通過抑制lncRNA Arid2-IR及其下游NF-κB的活化、減輕腎功能衰竭小鼠腎臟及全身的炎癥反應而實現的，與Zhou等［19］的研究結果一致。進一步對小鼠糞便進行qPCR結果顯示，APS組益生菌（雙歧桿菌、乳酸桿菌）的基因表達量較模型組升高，而機會致病菌（大腸桿菌）的基因表達量明顯下降，提示菌群環境亦得到改善，這與Dong等［11］以APS治療腹瀉小鼠的糞便菌群檢測結果一致。為進一步探究APS對不同菌群的干預作用，后續研究還可將APS單味藥治療的慢性腎功能衰竭模型小鼠糞便進行包括宏基因組學在內的深度測序分析。

綜上，APS能通過維持腸道微生態對慢性腎功能衰竭小鼠的腎臟起保護作用。其機制可能是通過調節腸道菌群的動態平衡恢復腸道的正常生理功能，下調lncRNA Arid2-IR表達以減輕NF-κB磷酸化誘導的系統微炎癥狀態，修復腸道黏膜損傷，恢復腸道屏障功能的保護作用，減輕腎臟負擔，從而改善腎臟損傷。本研究結果為臨床應用APS及黃芪治療CKD患者，延緩其疾病進展提供了基礎理論依據。