黃芩苷對心力衰竭大鼠心律失常及心室肌細胞內質網應激-肌電穩定性的影響

王智，王娟，徐雷，趙東明△

黃芩苷是黃芩的有效提取物之一［1］，現代藥理學證實其具有抗炎［2］、抗腫瘤［3］、降壓［4］的作用，對于擴張型心肌病心室重構亦有較好的抑制作用［5］。已有研究證實，黃芩苷對異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）所致的心肌損傷具有保護作用，可穩定血流動力學指標，但并未進行系統深入的研究［6］。本課題組前期研究表明，黃芩苷對脂多糖損傷的人心肌H9c2細胞具有一定的保護作用，可減少心肌細胞凋亡，抑制線粒體損傷，提高細胞存活率［7］。有文獻報道，當心肌細胞發生過度內質網應激（ERS）時，會引起Kv4.3、Nav1.5等離子通道異常表達，導致心律失常［8］。目前，鮮有黃芩苷對心力衰竭大鼠心室肌細胞ERS與心律失常關系的相關報道。本研究以心室肌細胞ERS-肌電穩定性為切入點，探討黃芩苷對ISO所致心力衰竭大鼠室性心律失常、心功能的影響及其與心室肌細胞ERS-肌電穩定性的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物72只清潔級雄性Wistar大鼠，6周齡，體質量（200±20）g，購自吉林大學基礎醫學院動物實驗中心，動物生產合格證號：SCXK（吉）2011-0004。大鼠自由飲水、飲食，飼養環境溫度20～22℃，嚴格遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要試劑 黃芩苷（浙江江北藥業公司，批號13659，純度≥98%）；酒石酸美托洛爾片（阿斯利康制藥有限公司，國藥準字H32025391，批號A14202000531）；原位缺口末端標記（TUNEL）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號C1088）；人基質裂解素2（ST2）、腦鈉肽（BNP）試劑盒，兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、肌醇需酶1（inositolrequiring enzyme-1，IRE1）、C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）、縫隙 連接蛋 白43（connexin，Cx43）單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號分別為：ab256751、ab108816、ab181602、ab108615、ab37073、ab179823及ab235585），山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB2301）。

1.1.3 實驗儀器5180/R型多功能臺式離心機（德國Eppendorf公司）；WD-9413B型凝膠成像系統（北京六一生物科技有限公司）；MK3型酶標儀（美國Multiskan公司）；1703940型半干轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；BL420F生理儀（成都泰盟公司）；Langendorff裝置（上海奧爾科特生物科技有限公司）；DF-5A型心臟刺激儀（蘇州市東方電子儀器廠）；BX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；GE Vivid E9彩色超聲、ML6-15型高頻超聲淺表探頭（美國GE公司）。

1.2 心力衰竭模型制備與分組72只清潔級雄性Wistar大鼠采用隨機數字表法分為對照組，模型組，美托洛爾組，黃芩苷低、中、高劑量組，每組12只。根據文獻［4］，模型組大鼠予后頸部皮下注射5 mg（/kg·d）的ISO，對照組予后頸部皮下注射等體積0.9%NaCl注射液，連續注射7 d；美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組在模型組基礎上分別給予美托洛爾10 mg（/kg·d）及25、50、100 mg（/kg·d）黃芩苷灌胃，對照組給予等體積0.9%NaCl注射液灌胃，連續給藥4周。模型成功標準：左心室射血分數（LVEF）下降0.05，左心室舒張末期內徑（LVEDd）、左心室收縮末期內徑（LVESd）增大0.15 mm［4］。全部大鼠均造模成功。

1.3 心電圖檢測 于實驗第4周末，取各組大鼠進行腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（60 mg/kg）麻醉，待大鼠麻醉成功后固定于粘鼠板，四肢連接BL420F生理儀心電電極，持續觀察3 min，記錄大鼠心率及室性早搏發生情況，每分鐘出現1～4個室性早搏為偶發室性早搏，每分鐘室性早搏發生數≥5個為頻發室性早搏。

1.4 心功能檢測 于實驗第4周末取各組大鼠麻醉后固定于粘鼠板，清理大鼠胸前毛發，應用胸壁高頻超聲ML6-15型探頭對大鼠進行心功能檢測，觀察指標包括LVEF、LVESd及LVEDd，每只大鼠取3個連續完整心動周期測量平均值。

1.5 血清心力衰竭標志物檢測 各組大鼠進行心臟超聲檢查后，抽取尾靜脈血1 mL，靜置1 h后分離血清并于EP管中及時-80℃凍存，常溫下解凍樣本，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組大鼠血清中心力衰竭標志物BNP和ST2含量，檢測流程嚴格按照說明書操作。

1.6 Langendorff離體心臟灌注模型 于實驗第4周末，從各組中抽取6只大鼠，麻醉后沿胸骨左緣剪開胸腔，直接剪下心臟，置于預冷H-K液中（H-K液配制參照文獻［9］），修剪后充分暴露主動脈，主動脈與Langendorff裝置連接后，在37℃，8.65 kPa恒壓條件下，用95%O2-5%CO2飽和K-H液非循環式逆行灌注。待離體心臟灌注模型穩定復跳10 min后，冠脈流量控制在10～12 mL/min，冠脈壓力維持為9.3 kPa左右，進行恒流灌注，導管接壓力轉換器［9］。植入電極，正負電極均放置于左心室前壁，并且正負極距離保持1 mm左右，于主動脈根部固定參考電極，連接BL420F生物機能實驗系統記錄心肌單相動作電位（MAP），并計算心肌單相動作電位復極90%的時程（MAPD90）。

應用DF-5A型心臟刺激儀，記錄電極與刺激電極均放置于左心室前壁，兩者相距3 mm，BL420F生物機能實驗系統記錄有效不應期（ERP）：連續發放8個起搏刺激波S1后發放1個早搏刺激波S2，S1S1與S1S2設置為250 ms，S1S2間期自設置數值每次縮短10 ms幅度，直至經S2誘發無反應，再于無誘發反應數值基礎上增加10 ms，然后以-1 ms反掃直至S2不能誘發出動作電位，此時S1S2間期即為心室肌細胞ERP。計算并比較各組間ERP/MAPD90比值。

1.7 TUNEL染色檢測心室肌細胞凋亡情況 取每組剩余6只大鼠，頸椎脫臼處死后用眼科剪子取下心臟，剪下部分左心室組織，用4%多聚甲醛液進行固定，無水乙醇脫水，切片厚度保持在3～4 μm制作切片樣本，其余左心室組織樣本留取進行后續實驗，根據TUNLE試劑盒說明書進行操作，樣本經0.1%Trition X-100透化，加入3%H2O2200 μL，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次后，加入蛋白酶K滅活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒溫箱中避光孵育60 min。取出后經PBS沖洗3次加入DAPI反應液，反應20 min后沖洗封片。應用顯微鏡觀察左心室組織切片，褐色代表已凋亡細胞，藍色代表仍生存細胞，于200倍鏡下觀察各組大鼠心室肌細胞凋亡情況。凋亡指數（AI）＝各視野陽性細胞數/視野所有細胞總數×100%。

1.8 Western blot法檢測ERS信號通路蛋白及Cx43蛋白表達 取1.7各組大鼠留取的左心室肌組織樣本并制備組織勻漿（10%），裂解細胞后采用BCA法測定各組心室肌樣本蛋白濃度，制備上樣液。各組樣品均取10 μL和5 μL蛋白Marker，加入電泳裝置中，5%、10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。待電泳結束后將含蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉4 h，加入目標蛋白GRP78一抗（1∶800）、IRE1一抗（1∶1 000）、CHOP一抗（1∶800）、Cx43一抗（1∶1 000）及內參蛋白GAPDH（1∶800）一抗4℃封閉過夜。次日應用PBS于水平搖床洗膜3次，加入山羊抗兔二抗（1∶500）后常溫下孵育2 h。取出PVDF膜后，用PBS洗膜3次，ECL顯像，暗室曝光，掃描膠片，用Gel-Pro-Analyzer軟件進行圖像處理，計算所測條帶光密度值。實驗獨立重復3次。

1.9 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。χ2檢驗組間多重比較，采用校正后的檢驗水準，P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖檢查結果 與對照組比較，模型組大鼠心率增快，室性早搏發生率增高（P＜0.05）；與模型組比較，美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心率降低，室性早搏發生率降低（P＜0.05）；與美托洛爾組比較，黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心率升高，室性早搏發生率差異無統計學意義；黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心率依次降低（P＜0.05），室性早搏發生率差異無統計學意義，見表1。

Tab.1 Comparison of heart rate and ventricular premature beat between six groups表1各組大鼠心率及室性早搏情況比較 （n=12）

2.2 各組大鼠超聲心動圖的變化 與對照組比較，模型組大鼠LVESd、LVEDd升高，LVEF降低（P＜0.05）。與模型組比較，美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組LVEF升高，LVESd、LVEDd降低（P＜0.05）。與美托洛爾組比較，黃芩苷低、中劑量組LVEF降低，LVESd、LVEDd升高（P＜0.05）；黃芩苷高劑量組與美托洛爾組差異均無統計學意義。黃芩苷低、中、高劑量組LVEF依次升高，LVESd、LVEDd依次降低（P＜0.05），見圖1、表2。

2.3 各組大鼠血清心衰標志物的變化 與對照組比較，模型組大鼠血清ST2、BNP水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組血清ST2、BNP水平降低（P＜0.05）。與美托洛爾組比較，黃芩苷低、中劑量組血清ST2、BNP水平升高（P＜0.05），高劑量組與美托洛爾組差異無統計學意義。黃芩苷低、中、高劑量組血清ST2、BNP水平依次降低（P＜0.05），見表3。

2.4 各組大鼠Langendorff離體心臟灌注模型ERP、ERP/MAPD90情況 與對照組比較，模型組大鼠心室肌細胞ERP、MAPD90增大，ERP/MAPD90減小（P＜0.05）。與模型組比較，美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組心室肌細胞ERP、MAPD90降低，ERP/MAPD90升高（P＜0.05）。與美托洛爾組比較，黃芩苷低、中劑量 組ERP、MAPD90升 高 ，ERP/MAPD90降 低（P＜0.05）；高劑量組與美托洛爾組差異均無統計學意義。黃芩苷低、中、高劑量組心室肌細胞ERP、MAPD90依次降低，ERP/MAPD90依次升高（P＜0.05），見表4。

Fig.1 Echocardiography of rats in each group圖1各組大鼠超聲心動圖

Tab.2 Comparison of LVEF,LVESd and LVEDd between six groups表2各組大鼠LVEF、LVESd、LVEDd比較（n=12，±s）

Tab.2 Comparison of LVEF,LVESd and LVEDd between six groups表2各組大鼠LVEF、LVESd、LVEDd比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，c與美托洛爾組比較，d與黃芩苷低劑量組比較，e與黃芩苷中劑量組比較，P＜0.05

組別LVEFLVESd（mm）LVEDd（mm）對照組0.857 2±0.024 61.73±0.114.58±0.19模型組0.698 0±0.034 9a3.46±0.12a6.27±0.25a美托洛爾組0.820 9±0.024 8b1.89±0.10b4.84±0.19b黃芩苷低劑量組0.720 5±0.038 4bc2.17±0.15bc5.79±0.25bc黃芩苷中劑量組0.785 9±0.026 0bcd2.03±0.14bcd5.13±0.20bcd黃芩苷高劑量組0.835 7±0.029 5bde1.83±0.10bde4.68±0.21bde F 56.463＊48.208＊34.224＊

Tab.3 Comparison of serum levels of ST2 and BNP between six groups表3各組大鼠血清ST2、BNP比較 （μg/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of ST2 and BNP between six groups表3各組大鼠血清ST2、BNP比較 （μg/L，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，c與美托洛爾組比較，d與黃芩苷低劑量組比較，e與黃芩苷中劑量組比較，P＜0.05

組別nST2BNP對照組1250.03±5.5864.92±5.58模型組1280.16±5.79a220.75±20.28a美托洛爾組1264.15±4.07b112.50±9.89b黃芩苷低劑量組1275.63±3.65bc176.08±11.56bc黃芩苷中劑量組1271.71±4.34bcd155.83±12.55bcd黃芩苷高劑量組1264.50±5.28bde106.75±16.39bde F 186.724＊246.843＊

2.5 各組大鼠TUNEL染色情況 與對照組比較，模型組大鼠心室肌細胞AI值明顯升高（F=289.711，P＜0.05）；與模型組比較，美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心室肌細胞AI值明顯降低（P＜0.05）。與美托洛爾組比較，黃芩苷低、中劑量組心室肌細胞AI值明顯升高（P＜0.05）；高劑量組與美托洛爾組差異無統計學意義。黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心室肌細胞AI值依次降低（P＜0.05），見圖2、3。

Tab.4 Comparison of ERP,MADP90 and ERP/MADP90 between six groups表4各組大鼠ERP、MADP90、ERP/MADP90比較 （±s）

Tab.4 Comparison of ERP,MADP90 and ERP/MADP90 between six groups表4各組大鼠ERP、MADP90、ERP/MADP90比較 （±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，c與美托洛爾組比較，d與黃芩苷低劑量組比較，e與黃芩苷中劑量組比較，P＜0.05

組別nERP（ms）MADP9（0ms）ERP/MADP90對照組648.67±3.4465.33±3.390.75±0.02模型組664.17±6.24a97.50±8.46a0.66±0.02a美托洛爾組650.17±3.31b66.83±3.87b0.75±0.01b黃芩苷低劑量組661.17±2.71bc89.17±3.43bc0.69±0.01bc黃芩苷中劑量組654.83±1.83bcd76.33±3.20bcd0.72±0.02bcd黃芩苷高劑量組650.50±2.26bde67.33±3.67bde0.75±0.02bde F 58.857＊168.426＊18.734＊

2.6 Western blot檢測結果 與對照組比較，模型組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP表達升高，Cx43表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，美托洛爾組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP表達降低，Cx43表達升高（P＜0.05）。與美托洛爾組比較，黃芩苷低、中劑量組心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP表達升高，Cx43表達降低（P＜0.05）；高劑量組與美托洛爾組差異均無統計學意義。黃芩苷低、中、高劑量組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP表達依次降低，Cx43表達依次升高（P＜0.05），見表5、圖4。

Fig.2 TUNEL staining results of baicalin on ventricular myocytes of rats with heart failure(×200)Fig.2各組心力衰竭大鼠心室肌組織TUNEL染色結果（×200）

Fig.3 Effects of baicalin on myocardial AI in rats with heart failure圖3黃芩苷對心力衰竭大鼠心室肌組織AI值的影響

Tab.5 Comparison of the protein expression levels of GRP78,IRE1,CHOP and Cx43 between six groups表5各組大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、CHOP及Cx43蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of the protein expression levels of GRP78,IRE1,CHOP and Cx43 between six groups表5各組大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、CHOP及Cx43蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，c與美托洛爾組比較，d與黃芩苷低劑量組比較，e與黃芩苷中劑量組比較，P＜0.05

組別GRP78IRE1CHOPCx43對照組0.17±0.030.20±0.040.17±0.022.58±0.22模型組0.40±0.04a1.16±0.08a1.23±0.09a0.25±0.06a美托洛爾組0.17±0.02b0.36±0.03b0.41±0.02b1.81±0.10b黃芩苷低0.31±0.03bc1.01±0.03bc1.05±0.06bc0.59±0.07bc劑量組黃芩苷中0.23±0.03bcd0.91±0.04bcd0.73±0.04bcd0.86±0.05bcd劑量組黃芩苷高0.17±0.01bde0.36±0.02bde0.42±0.03bde1.82±0.07bde劑量組F 46.492＊70.758＊132.413＊224.024＊

3 討論

Fig.4 Electrophoretic map of baicalin on GRP78,IRE1,CHOP and Cx43 in ventricular myocytes of rats with heart failure圖4各組心力衰竭大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、CHOP及Cx43表達電泳圖

心力衰竭是指心臟結構與功能發生異常，表現為心室壁變薄，心室腔呈擴張樣改變，心室過度充盈，射血無力等一系列臨床綜合征，多出現于心血管疾病的終末期［10］。心室重構是心力衰竭的病理學基礎，主要包括結構重構和電重構，兩者均是引發心力衰竭患者生活質量下降的重要因素。不僅如此，兩者還可相互影響，相互加重［11］。黃芩苷對不同心血管疾病的作用已成為心血管領域研究熱點，有望成為治療或輔助治療多種心血管疾病的有效藥物［12］。

有研究顯示，黃芩苷能改善ISO所致心力衰竭大鼠心功能，提高LVEF，減少體內水鈉潴留，降低循環機械應力傳導至心肌細胞，抑制BNP及ST2產生［13］。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心率增快，室性早搏發生率增高，LVESd、LVEDd增加，LVEF降低，血清BNP及ST2含量升高，經25～100 mg（/kg·d）黃芩苷灌胃后，上述指標均有所改善，且呈劑量依賴性，提示黃芩苷可改善ISO致心力衰竭大鼠的癥狀，但其具體機制仍不明確。

內質網是真核細胞合成蛋白的主要場所。當各種原因導致內質網穩態失衡時，易出現未折疊或錯誤折疊蛋白聚集于內質網中，細胞本身降解和重新折疊蛋白的過程即為ERS［14］，但持續而嚴重的ERS則可直接引發細胞凋亡［15］。心肌細胞凋亡不僅降低心功能，而且可引發心臟成纖維細胞增生并轉化為肌成纖維細胞。由于心肌細胞和成纖維細胞的靜息膜電位水平不同，兩類細胞間形成的電偶聯可降低心肌細胞除極速率和電活動傳導速度，引發心律失常［16］。從電生理角度分析，室性快速性心律失常或頻繁發作的室性早搏可導致心室收縮功能障礙，嚴重者可導致心臟擴大或心力衰竭［17］。由此可見，心室結構重構與電重構之間存在相互誘發的病理條件。

正常心肌細胞群均為單相動作電位，使用Langendorff離體心臟灌注模型可準確反映心肌細胞的去極和復極。K+外流形成MAPD90，主要反映0相去極化至3相復極末期，ERP反映0相去極化至3相復極中期。當Na+通道激活延遲，ERP則延長，由于ERP和MAPD90存在同步性變化，因此ERP/MAPD90比值更能反映心室肌電穩定性；其比值越小，心肌細胞除極引起折返性心律失常以及局部傳導阻滯的概率越大［18］。既往已有研究探索黃芩苷治療心力衰竭大鼠的作用機制，但大多停留在心室結構重構及分子信號通路的研究［19］，并未將心室重構及心律失常相關聯。無論是心臟的結構重構還是電重構出現嚴重變化，均會對整體產生影響，故而對兩方面共同研究方可得出較為科學、可信的結論。

心肌細胞縫隙連接是由縫隙連接蛋白組成的六聚體半通道橋梁，由內質網分泌，駐于心肌細胞膜表面，對心肌細胞之間的電傳導起決定作用。而心肌細胞內質網并不發達，一旦發生ERS，可能對縫隙連接蛋白的合成與表達產生影響［20］。賀智慧等［21］研究發現，阿霉素誘導的擴張型心肌病大鼠心室肌細胞存在ERS，并且ERS可能激發心室肌纖維化信號通路，引發Cx43表達減少，造成大鼠心律失常。為了印證黃芩苷是否也通過抑制ERS，減少心肌細胞凋亡并增加Cx43表達，減少室性早搏的發生，本次研究還對部分大鼠進行了Langendorff離體心臟灌注，進行TUNEL染色、ERS信號通路及Cx43蛋白檢測，降低離體心臟對凋亡的影響，以保障檢測結果的客觀性和準確性。結果顯示，與對照組比較，模型組心室肌細胞ERP/MAPD90比值降低，心室肌細胞AI值升高，ERS信號通路GRP78、IRE1、CHOP蛋白表達水平升高，Cx43蛋白表達水平降低。而經黃芩苷干預后，心室肌細胞ERP/MAPD90比值升高，AI值降低，GRP78、IRE1、CHOP蛋白表達水平降低，Cx43蛋白表達水平升高，且均呈劑量依賴性，提示ISO所致心力衰竭模型大鼠心室肌細胞發生ERS凋亡的同時，Cx43表達下調，心室肌細胞肌電穩定性降低，可能是造成模型組大鼠室性早搏發生率升高的原因；而黃芩苷可能通過調節ERS，恢復內質網內蛋白合成穩態，在減少心室肌細胞凋亡的同時，上調Cx43的表達，提升心室肌細胞肌電穩定性，在抑制心力衰竭大鼠心室結構重構的同時還可抑制電重構。另外，黃芩苷高劑量組大鼠心功能、心室肌細胞凋亡情況、Cx43表達及肌電穩定性療效與美托洛爾組無明顯差異，提示高劑量黃芩苷可與美托洛爾發揮幾近相同的作用，但其主要作用機制可能存在較大差異，美托洛爾是β受體阻滯劑，可能通過抑制心動過速，增加心臟舒張期供血，從而達到治療心力衰竭的作用，而黃芩苷則更可能傾向于通過抑制心室結構重構起到增加心肌電穩定性的作用。

綜上所述，黃芩苷具有改善ISO所致心力衰竭大鼠的心功能作用，減少心室肌細胞凋亡，減輕ERS，提高心室肌細胞Cx43表達及肌電穩定性，在逆轉心室重構的同時抑制電重構，有望成為心血管疾病的輔助用藥。