扶腎方對尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜超濾功能及VEGF-Notch信號通路的影響

楊波，王孟孟，孫林，鐘柯，李潔，楊洪濤△

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）患者主要的替代治療方式之一，其有效性取決于腹膜功能的完整性。由于使用含葡萄糖腹膜透析液，長期PD可致腹膜超濾功能逐漸下降，直至衰竭，最終迫使患者退出PD治療［1］。因此，明確腹膜超濾衰竭的具體機制，對于提高PD效能具有重要意義。研究表明，腹膜血管新生是引起超濾功能衰竭的重要原因之一［2］。中藥復方具有多靶點調控的優勢，在抑制腹膜血管新生和防治超濾衰竭方面應用前景良好［3］。本課題組前期研究發現，扶腎方（院內制劑：津藥制字Z20130941）可改善尿毒癥腹膜透析大鼠超濾功能，這一作用是否與抑制腹膜血管新生有關尚不明確。本研究通過利用5/6腎切除尿毒癥大鼠PD模型，探討扶腎方對尿毒癥PD大鼠腹膜超濾功能及腹膜組織Notch1、Delta-樣配體4（delta-like ligand 4，Dll4）、Notch胞內域（intracellular domain of Notch，NICD）、Hes1（hairy and enhancer of split homolog-1，Hes1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及血管內皮生長因子受體-2（vscular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的影響，以期為扶腎方防治PD超濾衰竭提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取50只SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量200～250 g，自由飲水攝食。大鼠購自北京維通利華實驗技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0006。

1.1.2 實驗藥物 扶腎方：黃芪15 g、淫羊藿15 g、陳皮10 g、半夏15 g、當歸10 g、丹參30 g、鬼箭羽30 g、熟軍10 g。上述中藥飲片購自天津中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。塞來昔布購自美國輝瑞制藥有限公司（批號：J20140072）。1.5%雙聯腹膜透析液（批號：G19121675）、4.25%雙聯腹膜透析液（批號：G18082462）均購自廣州百特醫療用品有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器DNA/RNA蛋白質共提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量預混試劑（北京天根生化科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、10×TBST緩沖液、180彩虹廣譜蛋白Marker、ECL超敏發光液（北京索萊寶科技有限公司），Notch1、NICD兔多克隆抗體（美國CST公司），Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR2、p-VEGFR2兔多克隆抗體，HRP標記羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）及內參GAPDH（北京博奧森生物技術有限公司），多功能酶標儀、超微量核酸蛋白測定儀（德國Thermo），電泳儀、快速轉膜儀、顯影儀（美國Bio-Rad），微量移液器、實時熒光定量PCR（qPCR）儀（德國Eppendorf），-80℃超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模50只大鼠適應性喂養7 d后，采用隨機數表法分為正常組、模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組、塞來昔布組，每組10只。模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組、塞來昔布組大鼠行5/6腎臟切除術建立尿毒癥模型，大鼠血肌酐較正常組上升2～3倍，提示尿毒癥造模成功［4］。造模成功后，以大鼠右下腹靠近腹股溝中點為腹腔注射部位，按每日100 mL/kg，腹腔注射1.5%腹膜透析液，腹腔內保留，不再抽出，注射4周。正常組予以每日生理鹽水2 mL灌胃，連續4周。

1.2.2 扶腎方制備 扶腎方藥劑經過提取、分離、濃縮、干燥及制粒而成。扶腎方顆粒成人服用劑量為每次18 g，每日2次，根據人和大鼠體表面積折算（折算系數為0.018）得出大鼠等效劑量為0.324 g，每日2次。

1.2.3 實驗給藥 扶腎方低劑量組每日扶腎方324 g/L，2 mL灌胃；扶腎方高劑量組每日扶腎方648 g/L，2 mL灌胃；塞來昔布組每日塞來昔布溶液1.8 g/L，2 mL灌胃；正常組和模型組每日生理鹽水2 mL灌胃。每組均連續灌胃4周。

1.2.4 腹膜超濾功能檢測 各組大鼠規律腹腔注射1.5%腹膜透析液4周末，行腹膜平衡實驗檢測大鼠腹膜超濾功能。腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液25 mL，4 h后用5%水合氯醛（6 mL/kg體質量）麻醉大鼠，先抽吸腹腔液體計量，再打開腹腔，收集腹腔內未抽凈的液體并計量。超濾量=（紗布吸水后的質量-紗布的質量）×1 mL/g+腹腔抽吸量-腹腔注射量。

1.2.5 標本留取及血肌酐的檢測5/6腎切除4周后，從大鼠眶后靜脈叢取血，應用7100型日立全自動生化分析儀檢測血肌酐（酶法）。規律腹腔注射腹膜透析液4周，腹膜平衡實驗計算超濾量后脊椎脫臼法處死大鼠，大鼠仰臥位固定于鼠板，沿腹白線剪開腹壁，于冰盤上取出腹膜組織，一部分于液氮中保存用于qPCR、蛋白免疫印跡實驗，其余部分于10%福爾馬林中固定用于HE染色。

1.2.6 HE染色觀察腹膜形態學變化 取大鼠腹膜組織，常規固定、脫水、石蠟包埋、切片后，行HE染色，光鏡下觀察大鼠腹膜形態學變化。

1.2.7 qPCR檢測Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGF的mRNA水平 按試劑盒說明書從每組腹膜組織中提取總RNA，測定提取RNA純度，反轉錄反應合成cDNA，再進行qPCR擴增，引物序列見表1。PCR反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，cDNA模板1.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.5 μL，加ddH2O至總體系25 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火32 s，40個循環。以β-actin為內參，用2-ΔΔCt法進行數據的相對定量分析。每組選取6個樣本，實驗重復3次。

1.2.8 蛋白印跡法檢測Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGF、VEGFR-2、p-VEGFR-2蛋白的表達 取腹膜組織150 mg標本加入預冷的RIPA裂解緩沖液，冰浴超聲20 min，4℃下12 000 r/min離心10 min后吸取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白質加入到4×上樣緩沖液中并在95℃下煮沸10 min。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質并印跡到活化的聚偏二氟乙烯膜上。封閉后，將膜與一抗GAPDH（1∶3 000）、Notch1（1∶500）、Dll4（1∶500）、NICD（1∶1 000）、Hes1（1∶1 000）、VEGFR-2（1∶1 000）、p-VEGFR-2（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）在4℃溫育過夜。緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫下孵育帶有HRP標記羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）1.5 h，緩沖液洗膜3次，每次10 min。使用化學發光成像系統采集圖像，以GAPDH為內參照進行帶灰度分析。將目標帶與參考帶的灰度比值作為蛋白質的相對表達水平，采用Image J v2.1.4.7軟件進行圖片處理。每組抽取6個樣本，實驗重復3次。

Tab.1 Primer sequences of qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，以Levene法進行方差齊性檢驗；組間多重比較，方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Games-Howell檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿毒癥模型一般情況 造模過程中大鼠死于腎切除術后失血1只，死于感染3只，余36只5/6腎切除大鼠血肌酐水平（77.04±9.11）μmol/L明顯高于正常組（28.74±3.73）μmol/L，差異有統計學意義（t=161.180，P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腹膜超濾量比較 正常組、模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組及塞來昔布組大鼠腹膜超濾量分別為（3.83±0.57）mL、（-19.01±1.04）mL、（-18.66±0.99）mL、（-14.95±1.59）mL和（-17.38±1.67）mL，差異有統計學意義（F=719.906，P＜0.05）；與正常組比較，模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組及塞來昔布組大鼠腹膜超濾量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，扶腎方低劑量組腹膜超濾量無明顯變化（P＞0.05），扶腎方高劑量組與塞來昔布組超濾量明顯增加（P＜0.05）；與扶腎方低劑量組比較，扶腎方高劑量組和塞來昔布組超濾量增加（P＜0.05）；與扶腎方高劑量組比較，塞來昔布組超濾量明顯下降（P＜0.05）。

2.3各組大鼠腹膜組織HE染色 正常組大鼠腹膜組織較連續和完整，腹膜間皮細胞呈扁平狀態，腹膜厚度較薄；模型組腹膜組織明顯增厚，部分間皮呈柱形，有大量炎性細胞浸潤，可見較多新生的小血管，伴有結締組織的增生。扶腎方低劑量組、高劑量組腹膜厚度介于正常對照組和模型組之間，血管新生較模型組減少，炎性細胞浸潤減輕，可見明顯血管淤血；塞來昔布組炎性細胞浸潤、腹膜增厚較模型組減輕，與扶腎方高劑量組病理變化相當。見圖1。

Fig.1 HE staining of peritoneal tissues of rats in the five groups(left×100,right×200)圖1各組大鼠腹膜組織HE染色（左×100，右×200）

2.4 各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGFmRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1mRNA表達下調，VEGFR-2、VEGFmRNA表達上調；扶腎方低劑量組Notch1、NICDmRNA表達下調，VEGFR-2、VEGFmRNA表達上調；扶腎方高劑量組VEGFmRNA表達上調；塞來昔布組Dll4、Hes1mRNA表達下調，VEGFmRNA表達上調（P＜0.05）。與模型組比較，扶腎方低劑量組NICD、Hes1mRNA表達上調，VEGFR-2、VEGFmRNA表達下調；扶腎方高劑量組Notch1、Dll4、NICD、Hes1mRNA表達上調，VEGFR-2、VEGFmRNA表 達 下 調 ；塞 來 昔 布 組Notch1mRNA表達上調，VEGFR-2、VEGFmRNA表達下調（P＜0.05）。與扶腎方低劑量組比較，扶腎方高劑量組Notch1、Dll4、VEGFmRNA表達上調，塞來昔布組Notch1mRNA表達上調（P＜0.05）。與扶腎方高劑量組比較，塞來昔布組Dll4mRNA表達下調（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2 and VEGF mRNA in peritoneal tissue of rats between the five groups表2各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGF mRNA表達水平比較 （±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2 and VEGF mRNA in peritoneal tissue of rats between the five groups表2各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、VEGF mRNA表達水平比較 （±s）

＊P＜0.05；a與正常組比較，b與模型組比較，c與扶腎方低劑量組比較，d與扶腎方高劑量組比較，P＜0.05

組別nNotch1Dll4NICD正常組101.01±0.191.05±0.231.00±0.07模型組90.64±0.15a0.40±0.29a0.46±0.14a扶腎方低劑量組90.63±0.07a0.73±0.140.87±0.11ab扶腎方高劑量組91.12±0.29bc1.47±0.30bc1.06±0.37b塞來昔布組91.41±0.33bc0.61±0.14ad0.67±0.26 F 6.348＊10.949＊4.073＊組別Hes1VEGFR-2VEGF正常組1.01±0.141.04±0.351.01±0.30模型組0.60±0.20a7.93±2.25a10.03±2.15a扶腎方低劑量組1.60±0.57b2.59±0.49ab2.56±0.79ab扶腎方高劑量組1.30±0.38b2.70±1.41b5.59±1.46abc塞來昔布組0.75±0.10a3.07±1.17b3.71±0.38ab F 4.994＊12.704＊27.270＊

2.5 各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達水平的比較 與正常組比較，模型組Notch1、Dll4、NICD、Hes1蛋白表達下調，VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達上調，扶腎方低劑量組Hes1蛋白表達下調，扶腎方高劑量組與塞來昔布組NICD蛋白表達下調（P＜0.05）。與模型組比較，扶腎方低劑量組Notch1、Dll4、NICD、Hes1蛋白表達上調，VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達下調，扶腎方高劑量組Dll4、Hes1蛋白表達上調，VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達下調，塞來昔布組Notch1、Dll4蛋白表達上調，p-VEGFR-2、VEGFR-2、VEGF蛋白表達下調（P＜0.05）。見表3、圖2。

Tab.3 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2,p-VEGFR-2 and VEGF protein in peritoneal tissue of rats between the five groups表3各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達水平比較 （±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2,p-VEGFR-2 and VEGF protein in peritoneal tissue of rats between the five groups表3各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達水平比較 （±s）

＊P＜0.05；a與正常組比較，b與模型組比較，c與扶腎方低劑量組比較，d與扶腎方高劑量組比較，P＜0.05

組別nNotch1Dll4NICDHes1VEGFR-2p-VEGFR-2VEGF正常組101.04±0.431.20±0.441.32±0.211.63±0.120.86±0.240.48±0.060.93±0.28模型組90.42±0.15a0.57±0.19a0.98±0.02a0.30±0.17a2.64±0.83a0.92±0.45a1.51±0.60a扶腎方低劑量組90.97±0.37b0.86±0.37b1.19±0.11b1.25±0.20ab1.36±0.19b0.42±0.30b0.81±0.27b扶腎方高劑量組90.71±0.440.90±0.27b1.07±0.16a1.43±0.16b1.42±0.49b0.42±0.20b0.93±0.27b塞來昔布組90.78±0.37b0.97±0.21b1.05±0.26a0.93±0.491.25±0.77b0.47±0.22b0.78±0.30b F 3.244＊4.252＊5.444＊14.310＊4.234＊6.633＊4.090＊

Fig.2 The expressions of Notch1,Dll4,NICD,Hes1,VEGFR-2,p-VEGFR-2 and VEGF protein in peritoneal tissue of rats between the five groups圖2各組大鼠腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達

3 討論

目前，全球接受PD治療的患者超過272 000例［5］。截至2017年底，我國PD患者為86 264例［6］。腹膜超濾功能衰竭發生的原因和機制復雜，其中腹膜血管新生起到了重要作用。抑制腹膜血管新生較抑制腹膜纖維化更能保護腹膜功能［7］。目前，臨床主要采用改進PD技術、預防PD相關腹膜炎、改善腹膜透析液的生物相容性等手段抑制PD相關腹膜血管新生，改善腹膜超濾功能，延緩超濾衰竭。近年有研究表明，部分單味及中藥復方具有抑制腹膜血管新生、抗腹膜纖維化的作用，如丹參酮、黃芪甲苷、腎康注射液等可改善由含葡萄糖腹膜透析液誘導的大鼠腹膜功能減退，防治腹膜纖維化［8］。中醫藥在抑制PD相關腹膜血管新生，防治超濾衰竭中的作用越來越受到關注。

血管新生是在原有血管基礎上，通過出芽或套疊增生而形成，該過程不僅與機體的正常發育和組織修復等密切相關，也參與腫瘤、動脈粥樣硬化等病變的發生與發展［9］。血管新生受VEGF及其受體VEGFR-2調控［10］，Notch通路也參與了血管形成的一系列過程，可直接影響尖端細胞的分化、內皮細胞的增殖、血管穩定性以及動靜脈分化等。VEGFNotch通路可影響血管新生過程的多個環節，可通過調控VEGF-Notch信號通路的不同作用靶點，達到調控血管新生的目的［11］。Notch信號通路是一條高度保守的經典信號轉導通路，參與細胞的增殖分化、組織和器官的發育等［12］。在哺乳動物中，Notch通路由Notch受體、Notch配體以及下游分子等組成。Notch受體共4個，包括Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。Notch配體有5個，包括Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1及Jagged2。Notch1受體表達于柄細胞，主要參與血管新生及血管正常生長。Dll4在尖端細胞表達，其表達過度或者減少，都會影響內皮細胞功能。Notch1與Dll4配體結合，抑制VEGF誘導柄細胞轉化為尖端細胞，上調Dll4表達，可影響Notch信號通路，防止內皮細胞過度出芽，使血管適度生長，從而維持血管有序發生及生長，保證新生血管的管腔形成，促使血管功能性成熟，從而達到調控血管新生的目的。而阻斷Notch信號通路能夠導致血管內皮細胞的過度增殖，產生大量無功能的新生血管，使血管灌注減少［13］。NICD是Notch的活性形式，NICD的表達可促進Notch信號通路的活化，Hes1是Notch信號通路重要的下游靶分子［14］。研究發現，Hes1的表達與Notch1高表達呈正相關，而Notch1的活性表現形式為NICD，說明NICD與Hes1的表達也具有一致性［15］。

有序的血管形成需要VEGF與Notch信號通路協調作用，VEGF包括不同的分子亞型和不同的VEGF結合受體，其中VEGFR-2與血管新生的關系最為密切［16］。Dll4是VEGF的下游分子，VEGF與其受體VEGFR-2結合后可引起Dll4高表達，過表達的Dll4與Notch受體結合，激活Notch信號通路。同時，Dll4可以通過對VEGF的負反饋來抑制其受體VEGFR-2的表達以減少血管內皮細胞的增殖與遷移，減少血管的過度生長［17］。塞來昔布是環氧化酶2抑制劑，可以抑制尿毒癥PD大鼠腹膜血管新生，改善腹膜超濾功能，已在實驗研究中得到廣泛應用［18］。本課題組前期研究表明，扶腎方可通過調節各種細胞因子表達，抑制腹膜間皮細胞上皮間質轉化，改善腹膜功能及腹膜纖維化［19］。VEGF-Notch信號通路與PD相關腹膜血管新生及腹膜超濾衰竭的關系鮮見研究報道。

本研究通過建立5/6腎切除大鼠慢性腎衰竭模型，腹腔注射含葡萄糖腹膜透析液，成功復制尿毒癥大鼠PD模型，觀察扶腎方對尿毒癥PD大鼠腹膜超濾功能及腹膜組織Notch1、Dll4、NICD、Hes1、VEGF、VEGFR-2表達的影響。結果顯示，模型組及各干預組大鼠腹膜超濾量明顯低于正常組，扶腎方高劑量組與塞來昔布組超濾量高于模型組和扶腎方低劑量組，塞來昔布組超濾量低于扶腎方高劑量組，提示扶腎方可改善腹膜超濾功能。腹膜HE染色顯示，扶腎方低劑量組與高劑量組大鼠腹膜新生血管較模型組明顯減少。與正常組比較，模型組大鼠腹膜組織Notch1、NICD、Dll4、Hes1的mRNA及蛋白表達均下調 ，VEGFR-2、VEGFmRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達上調。與模型組比較，扶腎方低劑量組NICD、Hes1mRNA及Notch1、NICD、Dll4、Hes1蛋白表達上調，扶腎方高劑量組Notch1、NICD、Dll4、Hes1mRNA及Dll4、Hes1蛋白表達上調，塞來昔布組Notch1mRNA及Notch1、Dll4蛋白表達上 調 ，各 干 預 組VEGFR-2、VEGFmRNA及p-VEGFR2、VEGFR-2、VEGF蛋白表達均下調。以上結果表明扶腎方的作用與塞來昔布類似。筆者推測在5/6腎切除尿毒癥大鼠PD模型中，扶腎方通過上調腹膜組織Notch1、NICD、Dll4、Hes1的mRNA及蛋白表達，下調VEGFR-2、VEGFmRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達，抑制腹膜血管新生，達到改善腹膜超濾功能，防治超濾衰竭的作用。

傳統醫學認為，尿毒癥為本虛標實證，本虛多為脾腎虧虛，標實以濕濁、瘀血為主，濁、瘀是脾腎虧虛產生的病理因素，又是誘導加重脾腎虧虛的主因。ESRD患者行PD治療后，尿毒癥病機關鍵未變，故PD相關腹膜超濾衰竭的主要病機仍為脾腎虧虛、濕濁瘀血內蘊。扶腎方正是據此病機關鍵組成的臨床效方，由陳皮、半夏、當歸、黃芪、淫羊藿、丹參、熟軍、鬼箭羽組成，治法融“補、消、和”于一體，效?！敖∑⒁婺I，化瘀降濁”。既往臨床及基礎研究表明，扶腎方可顯著延緩尿毒癥PD大鼠腹膜纖維化，改善腹膜超濾衰竭［19-20］，但該作用與腹膜血管新生的關系目前尚不明確。

綜上所述，本研究從動物實驗初步證實，扶腎方可通過上調腹膜組織Notch1、NICD、Dll4、Hes1的mRNA及蛋白表達，下調VEGFR-2、VEGFmRNA及VEGFR-2、p-VEGFR-2、VEGF蛋白表達，抑制腹膜血管新生，防治腹膜超濾衰竭，為臨床應用扶腎方防治腹膜超濾衰竭提供了實驗依據及理論支持。但扶腎方抑制腹膜血管新生，防治腹膜超濾衰竭是否還通過其他信號通路發揮作用尚需進一步深入探索。