RPL15在K562細胞向紅系分化過程中的功能和機制研究

彭濤，周唯君，周棟珍，李化，蘭金芝，李丹，周艷華，舒莉萍△

RPL15基因編碼的核糖體蛋白L15（ribosomal protein L15，RPL15）屬于真核生物核糖體60 S亞基的一個組成部分，蛋白分子質量約為24 ku。研究表明RPL15主要定位于核仁，這不僅利于核仁結構的形成與維持，還可能與核糖體RNA的成熟過程有關［1］。RPL15除了參與核糖體的組裝與蛋白質的合成過程外，也與多種癌癥的發生發展有關。既往研究表明，RPL15在結腸癌、食管癌及胃癌中表達量明顯增高［2］，但在胰腺導管腺癌和皮膚鱗狀細胞癌中表達量明顯減少［3］。近期研究證實在先天性純紅細胞再生障礙性貧血（Diamond-Blackfan anemia,DBA）患者中RPL15基因存在突變［4］。本課題組前期研究發現，極光激酶抑制劑達努塞替（Danusertib，Danu）可通過極光激酶B/核糖體p70S6蛋白激酶/核糖體蛋白L15（Aurora B/p70S6K/RPL15）信號通路下調RPL15，引起K562細胞發生程序性死亡［5］。人紅白血病K562細胞系作為研究細胞分化的模型，可在體外經誘導向紅系分化，并且表達糖蛋白A和帶3蛋白等紅系特征性的蛋白［6］，提示RPL15作為Aurora B/p70S6K/RPL15信號通路軸中的關鍵下游分子，可能與紅系造血細胞發育分化密切相關。目前，RPL15在紅系造血發育過程中的生物學功能及具體作用機制尚未闡述清晰。因此本研究以紅白血病K562細胞為實驗對象，初步探究下調RPL15對K562細胞紅系分化的影響，以期揭示RPL15在紅系造血發育相關疾病中的功能和分子機制。

到杭州之后，李樹化很快就出現了鋼琴曲創作的一個高潮時期：當年就譜寫了鋼琴曲《湖上春夢》，1929年完成了鋼琴曲《藝術運動》，1930年創作了鋼琴曲《林間》。這一年的年底，他完成了獻給妻子的鋼琴曲《如此溫柔》，表達了他對妻子的一往深情和感恩。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與質粒K562細胞系購自普諾賽生命科技有限公司，由本實驗室傳代并凍存。短發夾核糖核酸（shRNA）：RPL15-shRNA1、RPL15-shRNA2和NC-shRNA等3種pGPU6/GFP/Neo-shRNA質粒均由上海吉瑪制藥技術有限公司構建。所用到的核苷酸序列見表1。

Tab.1 Target nucleotide sequence of plasmid表1質粒的靶位點核苷酸序列

1.2 試劑與儀器 胎牛血清、RPMI 1640基礎培養液、青霉素和鏈霉素抗生素等細胞培養相關試劑均購自美國Gibco公司；氯化血紅素（hemin）購自索萊寶生物科技有限公司；TRIzol購自Ambion公司；逆轉錄試劑盒（RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit）購 自Thermo Fisher Scientific公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司；3,3',5,5'四甲基聯苯胺（TMB）購自Sigma公司；兔抗人RPL15、β-actin單克隆抗體以及山羊抗兔二抗購自Abcam公司；CD71、CD235a流式抗體購自美國eBioscience公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）引物購自Invitrogen公司。Celetrix電轉儀購自達科為公司；CFX96 Real-Time PCR儀購自Bio-Rad公司；FC500流式細胞分析儀購自Beckman公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 K562細胞培養 用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液于5%CO2的孵箱37℃恒溫培養。

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：G-1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以淫羊藿苷峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，22個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n＝6），表明本方法精密度良好。

柱狀彈丸超高速碰撞薄板產生的碎片云和球形彈丸的結構有所不同，碎片云外形具有泡狀結構。Piekutowski等基于柱狀彈丸碎片云X射線圖像，提出了描述柱狀彈丸產生的泡狀結構的碎片云模型[25-26]。Schonberg基于一維沖擊波理論提出了改進的柱狀彈丸碎片云模型[27]，該模型給出了柱狀和類柱狀彈丸碎片云各個特征速度的理論表達式，并且通過熱力學分析，給出了碎片云中固、液、氣三種相態下材料質量的計算方法。

結直腸癌患者血糖狀態 根據空腹血糖狀態檢測結果統計，109例結直腸癌患者中血糖正常者(空腹血糖狀態為3.9～6.1 mmol/L)為75例，占結直腸癌患者總數的68.80%；高血糖狀態者(空腹血糖>6.1 mmol/L)為34例，占結直腸癌患者總數的31.19%；其中并發糖尿病者(空腹血糖≥7.0 mmol/L并經臨床確診)為18例，占結直腸癌患者總數的16.51%。

1.3.4 qPCR檢測細胞RPL15和紅系分化相關基因的表達RPL15基因表達檢測：使用hemin誘導K562細胞向紅系分化，分別設置0、24、48、72、96和120 h組。紅系分化相關基因表達檢測：電轉染RPL15-shRNA2質粒的K562細胞采用hemin誘導培養72 h。收集對應組別細胞，用TRIzol提取總RNA，取1 μg RNA采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。逆轉錄條件：42℃1 h，70℃5 min。通過qPCR試劑盒和CFX96 Real-Time PCR儀進行qPCR。擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共39個循環。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達水平，實驗重復3次。所用引物序列見表2。

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Tab.2 qPCR primer sequence表2 qPCR引物序列

2.3RPL15對K562細胞紅系分化過程中血紅蛋白表達的影響 對照組0、24、48、72 h TMB染色陽性細胞比例分別為（3.15±0.28）%、（21.97±1.66）%、（36.62±1.00）%、（43.40±2.38）%，RPL15-shRNA2組4個時點染色陽性細胞比例分別為（1.77±0.81）%、（17.06±1.11）%、（27.40±2.86）%、（36.81±3.59）%。結果顯示，與對照組相比，RPL15干擾后，24、48和72 h TMB染色陽性細胞比例明顯下調（n=3，t分別為4.251、5.404、3.299，均P＜0.05），見圖3A。各個時間點代表性TMB染色結果見圖3B。

1.3.2 RNA干擾（RNAi）技術抑制K562細胞中RPL15基因的表達 培養K562細胞至對數期進行RNA干擾實驗，取3×106個細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2次，加入20 μL電轉液懸浮細胞，向細胞懸浮液中加入4 μg質粒，混勻并加入到20 μL體系電轉杯內，用電轉儀選擇針對K562細胞的程序電轉細胞，電擊之后將細胞轉移到預熱的RPMI 1640完全培養基中，繼續培養到指定時間進行RNA干擾效率檢測及相關實驗。

1.3.3 K562細胞紅系分化誘導K562細胞于誘導前1 d更換新鮮的RPMI 1640完全培養基，并使其在誘導當天處于對數生長期。第2天加入40 μmol/L hemin，誘導K562細胞向紅系分化。

2.1RPL15在K562細胞紅系分化過程中的表達變化qPCR結果顯示，RPL15的mRNA表達于誘導24～48 h逐漸升高，且在48 h表達水平達到高峰。而誘導72～120 h細胞內RPL15的表達水平卻逐漸下降（n=3，F=30.938，P＜0.01），見圖1A。同時，蛋白水平檢測結果與mRNA水平一致（n=3，F=175.682，P＜0.01），進一步證實RPL15蛋白在K562細胞紅系分化過程中表達呈先升高后下降的趨勢，見圖1B、C。

1.3.7 流式細胞術檢測CD235a與CD71的表達 利用hemin誘導培養電轉染對照和RPL15-shRNA質粒的K562細胞72 h，收集1×106個K562細胞，PBS沖洗2遍，用100 μL PBS重懸細胞，每管添加5 μL APC-CD71和2.5 μL PE-CD235a直標一抗，輕柔混勻后于冰上避光孵育30 min。PBS洗滌細胞2遍，細胞重懸于1 mL PBS中，FC500流式細胞分析儀上機進行檢測，實驗重復3次。

“嘖嘖，不愧是與云織星人成對出現的獵影星人，小小年紀就懂得舍命相救。”喵星飛鼠大使鄙夷地叫道，“能幫她擋住拳頭，那你還能幫她擋住這個嗎？”喵星飛鼠大使說著，左手一揮，一支飛鼠小隊從他身后閃出，在空中架起一個大號導彈發射器。

2.2RPL15-shRNA質粒干擾效率的檢測qPCR結果顯示，與對照組相比，RPL15-shRNA2質粒能有效下調K562細胞中RPL15的mRNA表達水平（n=3，F=14.901，P＜0.01），見圖2A。Western blot實驗結果顯示，與對照組和RPL15-shRNA1組相比，RPL15-shRNA2質粒能有效下調K562細胞中RPL15的蛋白表達水平（n=3，F=231.208，P＜0.01），見圖2B、C。采用RPL15-shRNA2質粒進行后續相關實驗。

2 結果

1.3.6 TMB染色檢測K562細胞紅系分化過程中血紅蛋白表達情況 采用電轉染方式將NC-shRNA（對照組）和RPL15-shRNA2質粒導入K562細胞中，將轉染后的細胞培養于含有hemin的培養液中，分別設置0、24、48和72 h組。向1 mL 0.4%TMB中加入5 μL 30%雙氧水混勻即為染色液，染色液現配現用。取hemin誘導不同時間點K562細胞，離心收集，PBS洗1遍后，重懸于200 μL PBS中。取50 μL上述細胞懸液加入50 μL染色液混勻后，室溫放置2～3 min。吹打均勻后取一滴于載玻片上，顯微鏡下拍照。另取細胞懸液在血球計數板上計數500個細胞，計算聯苯胺陽性細胞比例（利用聯苯胺陽性細胞比例來代表不同時間點合成血紅蛋白K562細胞的數量。通過聯苯胺染色陽性率，結合時間分組，說明K562細胞紅系分化情況），實驗重復3次。聯苯胺染色陽性細胞百分率越高，提示該組總的血紅蛋白含量越高。

1.4 統計學方法 使用Graphpad Prism 8.0對數據進行統計分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2個樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnet-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

1.3.5 Western blot實驗檢測RPL15蛋白的表達 檢測RPL15蛋白的表達變化：使用hemin誘導K562細胞向紅系分化，分別設置0、24、48、72、96和120 h組。檢測RPL15蛋白的干擾效率：將RPL15-shRNA質粒電轉染至K562細胞中，培養72 h后收集適量K562細胞。提取各組細胞總蛋白，采用12%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，封閉液封閉2 h，加入兔抗人RPL15單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，洗膜液洗膜3次后加入山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜后曝光顯像，實驗重復3次。

Fig.1 Changes of RPL15 expression during erythroid differentiation of K562 cells圖1 RPL15在K562細胞紅系分化過程中的表達水平變化

Fig.2 Interference efficiency of RPL15-shRNA plasmid in K562 cells圖2 RPL15-shRNA質粒在K562細胞中的干擾效率

Fig.3 Changes of hemoglobin expression in K562 cells before and after RPL15 interference(×200)圖3 RPL15干擾前后K562細胞中血紅蛋白表達變化（×200）

2.4RPL15對K562細胞紅系分化的影響qPCR結果顯示，RPL15-shRNA2組中α-、β-、ε-和γ-珠蛋白基因的相對表達量均顯著低于對照組（均P＜0.05），見表3。流式細胞術檢測結果顯示，RPL15-shRNA2組CD235a+CD71+細胞比例較對照組顯著降低（43.10%±3.15%vs.62.07%±2.97%，n=3，t=7.590，P＜0.01），見圖4。

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of globin gene between the two groups表3各組珠蛋白基因mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of globin gene between the two groups表3各組珠蛋白基因mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表4同

組別 α-globinβ-globinε-globinγ-globin對照組1.01±0.021.01±0.021.01±0.021.01±0.02 RPL15-shRNA2組0.76±0.110.60±0.070.63±0.030.78±0.12 t 3.911＊9.969＊＊15.830＊＊3.292＊

Fig.4 Knockdown of RPL15 inhibited the expression of erythroidrelated genes in K562 cells圖4在K562細胞中敲低RPL15抑制紅系相關基因表達

2.5RPL15對紅系分化相關信號通路分子表達的影響qPCR結果顯示，與對照組相比，RPL15-shRNA2組P53的mRNA表達水平顯著上調（P＜0.01），而GATA1和HSP70的mRNA表達水平均顯著下調（均P＜0.01），見表4。

Tab.4 Comparison of expression levels of P53,GATA1 and HSP70 mRNA between the two groups表4各組P53、GATA1及HSP70 mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of P53,GATA1 and HSP70 mRNA between the two groups表4各組P53、GATA1及HSP70 mRNA表達水平的比較（n=3，±s）

組別HSP70GATA1P53對照組1.02±0.031.02±0.031.02±0.03 RPL15-shRNA2組0.61±0.130.75±0.091.77±0.20 t 5.486＊＊4.917＊＊6.517＊＊

3 討論

3.1RPL15與DBA的聯系 目前研究表明核糖體蛋白與DBA的發生密切相關，DBA是一種罕見的先天性紅細胞減少和遺傳性骨髓衰竭綜合征，其主要特征是患者骨髓中髓系成熟正常，但選擇性地缺乏紅細胞前體［7］。目前研究發現多數誘使DBA遺傳病變的基因屬于核糖體蛋白基因家族，因此DBA被認為是一種核糖體疾病［8-9］。近年來，與DBA疾病相關的核糖體蛋白突變研究在細胞水平上陸續開展。在利用RNAi技術下調原代人造血干細胞的研究中發現，與其他譜系相比，下調RPS19選擇性誘使人紅系造血祖細胞發生細胞周期阻滯［10］。此外，研究發現RPL11突變導致紅系祖細胞增殖顯著下降，紅系分化延遲［11］。上述研究提示相關核糖體蛋白突變與紅系分化密切相關。值得注意的是，已有研究在DBA患者中發現RPL15基因的突變［12］。鑒于RPL15在DBA疾病中的生物學功能及具體作用機制尚未闡述清晰。本研究利用RNAi技術成功下調K562細胞中的RPL15，初步探究RPL15對K562細胞紅系分化的影響。

3.2 抑制RPL15的表達將抑制K562細胞紅系分化 本實驗結果表明RPL15在K562細胞紅系分化過程中表達呈先升高后下降的趨勢。由于原始紅細胞增殖分化約72 h后需要脫核及去除細胞器而進一步分化為成熟紅細胞，因此在K562細胞紅系分化前期過程表達升高可能提示RPL15是潛在的促進紅系分化的因子。沉默RPL15表達后誘導K562細胞向紅系分化發現，與對照組相比，RPL15敲低使細胞內α-、β-、ε-和γ-珠蛋白的mRNA表達水平降低；此外，紅系細胞表面特異的糖蛋白標志分子CD235a和紅系分化標志物CD71雙陽性細胞比例降低。上述結果提示，抑制RPL15的表達將抑制K562細胞紅系分化，進一步證實RPL15是潛在的促進紅系分化的因子。

3.3RPL15調控紅系發育分子通路的探討 相關研究證實，核糖體蛋白突變誘使的DBA患者貧血表型的形成與P53通路密切相關［13］。本研究結果顯示，在K562細胞向紅系分化過程中，沉默RPL15使得細胞中P53mRNA表達水平增高。當RPL15發生突變時，核糖體的正常裝配過程出現失衡，將導致核糖體前體RNA降解和在核仁內產生游離核糖體蛋白［14］。游離核糖體蛋白可進入核基質與鼠雙微染色體2基因（murine double mimute2，MDM2）結合［15］。在與上述游離核糖體蛋白結合后，MDM2的泛素連接酶的活性受到抑制，而這會誘使P53基因的表達增高，從而導致相應細胞周期停滯和凋亡的發生［16］。此外，有研究表明紅系分化過程中HSP70可從細胞質遷移到細胞核而結合GATA1，以保護GATA1免受caspase-3介導的裂解，從而調控紅系正常分化發育［17-19］。本研究結果顯示，在K562細胞向紅系分化中，沉默RPL15表達使GATA1及HSP70的mRNA表達水平發生下調，提示HSP70轉錄水平的下調將誘使GATA1發生caspase-3介導的裂解，進一步導致RPL15敲低細胞的紅系分化障礙。

綜上所述，本研究通過RNAi技術敲低K562細胞中的RPL15，發現抑制RPL15的表達將抑制K562細胞的紅系分化，進一步提示RPL15是潛在的正向調控紅系分化的因子。此外，初步探究表明P53相關通路、GATA1及HSP70可能參與了RPL15敲低對K562細胞紅系分化的調控過程，為進一步探究RPL15在相關紅系疾病發生發展中的作用奠定了實驗基礎。