阿爾茨海默病病人血液、尿液的代謝組學研究

崔宇 王曉坤 張燕 孫宏

AD是現階段世界范圍內尚無確切治療方案的一種神經退行性疾病[1]。AD前期多不易被發現,或以輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)被臨床所發現,由于早期缺乏特異性診斷方法,導致其生存率較低[2]。

代謝組學是近些年才快速開展起來的組學研究,可通過研究早期潛在的代謝標志物為生物系統提供完整、準確、動態的代謝網絡圖，并進一步揭示生物體新陳代謝過程中代謝產物的動態變化規律，有助于全面理解疾病的變化過程和闡釋發病機制及體內物質代謝途徑等[3]。本研究旨在探討AD病人血液和尿液的代謝組學變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究對黑龍江省農墾地區9個管理局的66家福利院共1862名≥65歲且未患過腦血管疾病的老年人進行的流行病學調查。根據有無AD將研究對象分為AD組和對照組。

AD組的納入標準：年齡≥65歲；按照美國精神醫學會的《精神障礙診斷和統計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)標準診斷癡呆，采用美國國立神經病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關疾病協會(NINCDS-ADRDA)標準診斷AD。

對照組的納入標準：年齡≥65歲；現場調查者訪問和體檢過程中未發現認知功能衰退或損害的征象，MMSE測試成績均在正常范圍內。從已確定的AD組和對照組中隨機篩選出34例AD病人和31例健康老年人進行檢測。本研究遵照《赫爾辛基宣言》的原則實施,研究對象均已知情同意。

1.2 實驗儀器與試劑 氨基酸自動分析儀(L-8800，日本日立公司)；Quattro micro液相色譜-質譜聯用儀， 混合氨基酸標準品(美國，Sigma公司)；甲酸(色譜純，北京Dikma公司)；乙腈(色譜純，北京Dikma公司)；甲醇(色譜純，北京Dikma公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液及尿液的采集：采集血樣前3 d，給予受試對象相同飲食，加強樣本基礎質控。于第4天清晨7:00～9:00時取空腹靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，取上層血清，置于EP管中，-80 ℃低溫冰箱保存。

采集晨中段尿20 mL,收集于50 mL潔凈塑料管中， 3000 r/min室溫離心10 min,精確吸取4.0 mL尿樣上清液，置入5.0 mL潔凈的離心管中， 12 000 r/min，4 ℃，離心10 min；精確吸取2.0 mL分別置于1.5 mL潔凈的EP管中，每管1 mL,于-80 ℃冰箱中凍存備用。

1.3.2 血清及尿液氨基酸分析 將血清及尿液樣品室溫條件下解凍。取0.5 mL血清、1.0 mL尿樣分別置于5.0 mL容量瓶中，分別加10%磺基水楊酸除蛋白，定容，混勻；用10 mol/L氫氧化鈉分別調pH至2.2；離心,取上清液分別置于EP管中，備檢。取上清液1.5 mL，過0.45μm水性微孔濾膜到上機進樣瓶中，L-8800氨基酸分析儀分別檢測尿液和血清中17種游離氨基酸含量。

1.3.3 尿樣超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜聯用技術分析

1.3.3.1 樣品前處理及檢測:將尿液樣品室溫下解凍。12 000 r/min轉速于4 ℃下，離心10 min，取上清300μL，加入300μL雙蒸水稀釋，渦旋混勻，轉入自動進樣瓶中，進樣檢測，進樣量為2μL。

1.3.3.2 高效液相色譜串聯質譜數據分析:原始數據通過Waters Micromass Markerlynx Application Version 4.0完成采集，Markerlynx用來進行峰選擇和峰調整。數據經Markerlynx導入EXCEL，形成三維數據矩陣，在SMICA-P 11.0操作模式下，建立工程，實現多變量主成分分析(PCA)。

1.3.3.3 生物標志物的確定及結構解析:根據PCA初步確定出可能的生物標志物，根據二級質譜中的分子質量檢索Metlin確定出未知代謝物的結構和分子式。查閱相關數據庫，得到相應化合物的mol文件。利用Masslynx軟件將文件導入相應的二級質譜圖中，選擇相應的正、負離子模式，進行massfragment匹配分析，篩選出最有可能的一種或幾種化合物。

2 結果

2.1 尿液中游離氨基酸水平 2組受試對象的尿液中均檢出了15種氨基酸：天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸；另外異亮氨酸和脯氨酸未檢出。另外，2組尿液中蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸和賴氨酸的水平差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 血液中游離氨基酸水平 2組受試對象的血清中，17種氨基酸均得到檢出。另外，2組血清中蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組尿液和血液中游離氨基酸含量比較

2.3 尿液中生物標志物的篩選和確定 根據多變量偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)篩選AD組病人尿液中的生物標志物。在正、負離子化模式下，參照Scripps、ChemSpider和HMDB數據庫，推斷15種化合物可能的結構依次為N-丙烯酰基-甘氨酸、精氨基琥珀酸、脫硫生物素、L-乙酰肉堿、異丁酰基-L-肉堿、C16二氫神經鞘氨醇、壬二酸、雌二醇-1,3,5,(10),7-4-3,17α-二醇、L-天門冬氨酰-4-磷酸鹽、L-谷氨酰胺、對甲酚-葡糖苷酸、本膽烷醇酮-葡糖苷酸、5-L-谷酰基甘氨酸、氨蝶呤、胞嘧啶核苷。上述物質在對照組中均未檢出。

3 討論

3.1 游離氨基酸代謝水平對AD機體的影響 氨基酸參與機體內多種活性物質的合成和代謝，在機體的學習記憶、神經傳導、免疫功能和受體功能等方面發揮著重要作用[5]。氨基酸的檢測對于某些疾病的篩查、診斷和治療具有重要意義[6]。氨基酸是腦內重要的神經遞質，大腦區域特定部位的一些氨基酸含量與學習記憶能力有關，對學習記憶和突觸形成至關重要。天門冬氨酸和谷氨酸等興奮性氨基酸對神經元有興奮作用，大量釋放可損傷神經細胞，導致學習記憶障礙[7]。本研究AD組尿液中天門冬氨酸和谷氨酸排泄量減少，提示它們在AD病人體內可能發生了代謝紊亂，過度的轉運和傳導，可刺激損傷神經元，造成記憶損害。蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸是人體必需氨基酸，能夠增強機體免疫，改善記憶力，提高中樞神經系統功能。絲氨酸是人體非必需氨基酸，在體內合成，可維護腦與心臟的功能。這些氨基酸在體內共同作用，經三羧酸循環作用于磷酸化合物，能夠促使腦細胞活性增強，恢復衰竭的神經元，改善中樞神經系統功能[8]。AD組血液中蛋氨酸的含量明顯低于對照組。機體內蛋氨酸在蛋氨酸腺苷轉移酶的催化作用下，與ATP反應，可生成Hcy。Hcy可以造成神經系統損傷。研究證實,Hcy是AD發生發展過程中一個重要的危險因素[9]。此外，Hcy可以經過轉硫途徑回轉生成半胱氨酸，本研究結果顯示AD組血清中半胱氨酸顯著高于對照組，這可能是機體內Hcy的濃度過高，其中一部分通過轉硫作用生成了半胱氨酸，導致血清中半胱氨酸的濃度異常升高。

AD病人血清中亮氨酸含量顯著低于對照組。最新研究發現，中樞神經系統的營養感應信號通路與外周組織的代謝分子調控網絡關系密切，其功能紊亂是促發代謝性疾病的重要原因，亮氨酸缺乏能夠激活下丘腦神經元的信號通路，下丘腦具有神經系統的功能，通過營養感應信號通路進而激活對外周組織的代謝調控。這可能是AD病人機體內氨基酸水平代謝紊亂的一個重要原因。

3.2 AD病人尿液中代謝物分析 N-丙烯酰基-甘氨酸是酰基甘氨酸的一種。研究發現，在一些先天性代謝紊亂癥病人中，某些特定的酰基甘氨酸排泄量相應增多[10]，本研究結果顯示，AD組中N-丙烯酰基-甘氨酸強度高于AD組，而AD組尿液中甘氨酸含量高于對照組。結合N-丙烯酰基-甘氨酸的形成過程，分析可得，AD組可能由于機體內代謝途徑發生紊亂，一方面，導致甘氨酸隨尿液排出體外的量增加，另一方面，導致體內甘氨酸和酰基輔酶A發生過度的代償反應，生成大量的N-丙烯酰基-甘氨酸。作為抑制性氨基酸，甘氨酸和其代謝物N-丙烯酰基-甘氨酸，在機體內代謝紊亂，致使其保護神經元不被損害的能力下降。

精氨基琥珀酸是鳥氨酸循環與瓜氨酸-一氧化氮循環的中間產物，在精氨基琥珀酸合成酶的作用下，由瓜氨酸與天門冬氨酸羧合而成，可進一步釋放出延胡索酸而生成精氨酸[11]。當機體發生代謝紊亂時，天門冬氨酸大量蓄積在體內，造成精氨基琥珀酸的合成增加，進而導致精氨酸在體內的增加，作為興奮性氨基酸，天門冬氨酸的過度轉運和傳導，可損傷神經細胞，導致學習記憶障礙。

L-乙酰肉堿(LAC)和異丁酰基-L-肉堿(ILC)同屬于醋酸酯類物質中的一種。除了在代謝活動中發揮的作用，LAC還具有神經保護、神經調節和神經營養的特性，這些對神經系統的保護功能使得其在阻止神經退行性疾病的進展過程中發揮了十分重要的作用。

L-天門冬氨酰-4-磷酸鹽，在機體內參與賴氨酸和高絲氨酸的生物合成。而賴氨酸具有提高并維護中樞神經系統功能的作用，因此，認為L-天門冬氨酰-4-磷酸鹽與AD的發生發展有關，可以作為AD的標志物之一。

L-谷氨酰胺是蛋白質合成中的編碼氨基酸，屬于人類機體內的一種非必需氨基酸，在體內可由葡萄糖轉變而來，也可由谷氨酸、纈氨酸及異亮氨酸合成。有研究者認為，谷氨酰胺酰基環化酶與AD的發生關系密切，有望成為治療AD的新靶點[12]。也有學者認為，血清中谷氨酰胺合成酶在作為診斷AD的生物標志物方面并沒有價值[13]。

5-L-谷酰基甘氨酸是一種興奮性氨基酸受體拮抗劑，與γ-氨基丁酸(GABA)的結構相似，GABA是一種抑制性氨基酸，可以減少谷氨酸的釋放，拮抗谷氨酸的毒性，能夠保護神經元處于抑制狀態，進而減少神經細胞的死亡。研究證明，抑制性氨基酸含量的降低，可造成AD病人學習記憶障礙[14]。

胞嘧啶核苷是構成核酸的嘧啶核苷之一。有研究報道，膽堿和胞嘧啶核苷是細胞膜的主要前體物，并且是細胞膜形成的主要調控元件，這2種物質聯合應用能夠升高機體磷脂水平、增加PC12細胞的表達和分泌，而β淀粉樣前體蛋白(APP)是細胞膜脂質雙分子層的主要跨膜蛋白，所以該研究認為這種刺激細胞膜生物合成的情況也可以用于刺激AD等神經退行性疾病中APP的分泌和神經突觸的形成[15]。

綜上所述，AD病人體內發生了氨基酸代謝紊亂或障礙，并發現了AD病人尿液中可能的生物標志物，這些結果對AD發病機制和臨床診療方面的研究提供了一個新的方向。