miR-107在卵巢癌組織中的表達及其對VEGFA的影響

孟桐羽，趙 濤，宋玉霞，趙 芳，李 盼，趙 健

(河北省石家莊市人民醫院婦科，河北 石家莊 050011)

卵巢癌(ovarian cancer)是病死率居女性生殖道系統首位的惡性腫瘤[1]，盡管近些年來對其診斷、手術方式、化學治療及分子靶向治療等手段取得了很大進步，但晚期患者5年的總生存率仍徘徊在40%左右[2]。卵巢癌高致死率的主要原因是發病隱匿且進展迅速，約70%患者就診時已發生盆腹腔病灶轉移。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)作為重要誘導血管生成的因子，在腫瘤生長、侵襲及遠處轉移過程中起重要作用[3-4]。先前多個研究報道了VEGFA在卵巢癌組織中表達上調[5-6]，但調控其表達上調的作用機制尚不明確。微小RNAs(miRNAs)在調控基因表達方面起重要作用，通過生物信息學預測得知，miR-107可以靶向調控VEGFA表達，且已被多個研究證實[7-8]。由于miRNAs對靶基因調控作用具有組織特異性，卵巢癌組織中VEGFA異常表達是否由miR-107的表達異常所致，目前尚未見報道。本研究檢測卵巢癌組織和正常卵巢組織中miR-107與VEGFA的表達情況，探討其在卵巢癌發生中的作用并分析二者表達的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年6月—2020年3月在河北省石家莊市人民院行手術治療的56例卵巢癌患者為病例組，術前均未接受新輔助化療，術后經病理檢查確診為上皮性卵巢癌。卵巢癌患者年齡29～74歲，平均(53.8±6.7)歲；FIGO手術病理分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期5例、Ⅲ期35例、Ⅳ期6例；腫瘤分化程度：高、中分化31例、低分化25例；組織學類型：漿液性腺癌37例、黏液性囊腺癌7例、子宮內膜樣癌12例；淋巴結轉移：陽性18例，淋巴結轉移陰性38例。選取同期因盆腔臟器脫垂、子宮肌瘤或宮頸癌行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織60例為對照組，其中子宮脫垂患者21例、子宮肌瘤患者28例，宮頸癌患者11例。對照組患者年齡40～73歲，平均(54.5±7.9歲)。2組患者年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

所有組織標本均在離體30 min內收集，迅速放入-80 ℃冰箱里低溫保存備用。標本和資料收集均由患者知情同意，并獲得石家莊市人民醫院倫理委員會批準通過。

1.2試劑與儀器 TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；RNA反轉錄試劑盒(美國Promega公司)；Go Taq Green Master Mix試劑盒、miRNA 提取試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒、miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒(均購于德國QIAGEN公司)；PCR 引物由上海生工合成；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3檢測方法

1.3.1RNA提取及逆轉錄 應用TRIzol試劑抽提卵巢癌組織及正常卵巢組織總RNA，檢測其純度、濃度及完整性后，將其逆轉錄成cDNA；應用miRNA提取試劑盒抽提卵巢癌組織及正常卵巢組織的miRNA，應用miRNA逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3.2RT-qPCR檢測VEGFA及miR-107的表達 目的基因VEGFA mRNA的檢測應用QuantiNovaTMSYBR Green PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，反應體系為：Green Master Mix 10.0 μL、Rox 0.1 μL、上游引物各 1.4 μL、cDNA 模板1.0 μL、最后加去離子水至20 μL；反應條件設定：95 ℃預變性5 min；然后40個循環95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s；最后95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、95 ℃延伸30 s。反應引物：目的基因VEGFA上游引物序列5′-ACCATGAACTTT-CTGCTGTCTTGGGTGCAT-3′，下游引物序列5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3′；內參GAPDH上游引物序列5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。目的基因miR-107應用miScript SYBR Green PCR Kit進行PCR擴增，反應體系為：Ultra SYBR Mix 5.0 μL、上游引物各1.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、最后加去離子水至10 μL；反應條件設定：95 ℃預變性15 min；然后40個循環95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s。目的基因miR-107的上游引物5′-GCCGAATTCAAAGCGAGATTCCATCAGCA-3′，下游引物5′-GCCGGATCCTGTCAACCC-AGAACTCAAAGG-3′；以U6基因為內參，其上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。根據系統生成的Ct值，采用2-△△CT法進行計算，獲得miR-107和VEGFA在各組織樣本中的相對表達量。

1.4統計學方法 應用SPSS 24.0統計軟件分析數據。計量資料采用t檢驗、單因素方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗。應用Pearson相關性分析對卵巢癌組織中miR-107和VEGFA表達量進行相關性分析。采用ROC曲線分析卵巢癌組織中miR-107表達對卵巢癌的診斷意義。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1VEGFA及miR-107的表達情況 VEGFA基因mRNA在卵巢癌組織中的相對表達量為2.04±0.65，在正常卵巢組織中的相對表達量為0.99±0.40，卵巢癌組織中VEGFA基因mRNA的表達量顯著高于正常卵巢組織，差異有統計學意義(t=10.427，P<0.001)。卵巢癌組織中miR-107的相對表達量為0.90±0.42，其在正常卵巢組織中的相對表達量為2.06±0.65，2組比較差異有統計學意義(t=11.319，P<0.001)。

2.2卵巢癌組織中VEGFA及miR-107表達水平的相關性分析 卵巢癌組織中VEGFA基因mRNA表達與miR-107表達水平呈顯著負相關(P<0.001)，見表1。

表1 卵巢癌組織中miR-107與VEGFA mRNA表達的相關性Table 1 Correlation between the expression of miR-107 and VEGFA mRNA in the ovarian cancer tissues

2.3不同FIGO分期患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA表達情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同FIGO分期的表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同FIGO分期卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達比較Table 2 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues in different FIGO stages

2.4不同組織學分級患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同組織學分級的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同組織學分級卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達比較Table 3 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues of different histological grades

2.5不同病理類型卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同病理類型的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同病理類型卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達比較Table 4 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues of different histological grades

2.6不同手術殘余病灶卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在不同手術殘余病灶的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 不同手術殘余病灶卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達比較Table 5 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues from different surgical residual lesions

2.7淋巴是否轉移患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達情況比較 卵巢癌組織中miR-107及VEGFA基因mRNA在是否發生淋巴轉移的表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 淋巴結是否轉移患者卵巢癌組織中miR-107及VEGFA mRNA表達比較Table 6 Comparison of miR-107 and VEGFA mRNA expression in ovarian cancer tissues of patients with or without lymph node metastasis

2.8卵巢癌組織中miR-107表達量對卵巢癌的診斷意義 miR-107診斷卵巢癌的ROC曲線下面積(AUC值)為0.936，95%可信區間為0.895～0.976，與AUC=0.5比較，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖1。說明卵巢癌組織中miR-107表達對卵巢癌的診斷具有較高的準確性。最優截斷點(cut-off值)為1.639，在最優截斷點敏感度和特異度分別為94.6%和76.7%。

圖1 卵巢癌組織中miR-107表達水平判斷卵巢癌的ROC曲線

3 討 論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，大多數在確診時已為晚期，發生了腫瘤浸潤、盆腹腔內種植播散，具有極差的預后。因此研究卵巢癌侵襲、轉移機制，同時尋找有效抑制卵巢癌侵襲、轉移的方法，是婦科腫瘤臨床醫師研究的熱點。VEGFA在腫瘤生長、侵襲及遠處轉移過程中起重要作用。本研究通過分析比較了VEGFA及可能調控其表達的miR-107在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達情況，并探討了它們與卵巢癌病理特征的關系，為后續研究卵巢癌發生、發展及轉移的作用機制提供前期基礎，同時為卵巢癌的診斷和治療尋找新的生物學標志物及藥物治療靶點。

20世紀70年代學者們提出了腫瘤血管生成理論，該理論指出如果沒有新生血管形成，腫瘤不會發生遠處轉移且只能生長到1～2 mm3，只有在新生血管形成后，腫瘤的生長會加倍增長，發生轉移的機率也隨之上升。形成新生血管是腫瘤生長和發生轉移的前提，這同樣適合于卵巢惡性腫瘤。VEGFA作為一種高效、特異的血管內皮細胞有絲分裂原，具有促進血管生成和維持血管內皮細胞通透性的功能，在腫瘤生長和侵襲轉移過程中發揮重要作用。先前的研究報道了VEGFA在卵巢癌組織中的表達顯著高于其在良性或低度惡性卵巢腫瘤中的表達，且VEGFA的表達水平與卵巢癌患者的化療敏感性及預后相關，其表達水平越高患者的預后則越差[9-11]。因此，VEGFA的高表達可能與卵巢癌的發生發展及患者預后密切相關。本研究應用RT-qPCR檢測了VEGFA基因mRNA在卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達情況，結果與先前的報道一致，VEGFA基因mRNA在卵巢癌組織中的表達水平顯著高于正常卵巢組織，表明VEGFA表達上調可能在卵巢癌變過程中起作用。淋巴結轉移陽性患者的卵巢癌組織中VEGFA表達水平顯著高于其在淋巴結轉移陰性患者中的表達，說明VEGFA表達可能與卵巢癌細胞的侵襲、轉移相關。FIGO分期是判斷卵巢癌患者預后重要的指標, 本研究結果發現Ⅲ、Ⅳ期患者的卵巢癌組織中VEGFA基因mRNA的表達水平顯著高于其在Ⅰ、Ⅱ期患者中的表達,，說明VEGFA表達水平有可能作為判斷卵巢癌患者預后的重要指標。

VEGFA表達升高在卵巢癌發生、發展過程中起重要作用，然而其在卵巢癌組織中表達上調的調控機制目前仍不明確。miRNAs作為一類重要的基因調控分子，在調控組織特異性基因表達方面起重要作用。近年來，研究發現卵巢癌組織中存在許多異常表達的miRNAs，miRNA通過與靶基因mRNA的3′UTR區結合，促進靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，從而來調控基因表達[12]。本研究首先通過生物信息學在線軟件(targetscan、 PicTar、miRanda)進行預測表明miR-107與VEGFA存在靶向關系，且先前許多文獻報道了異常表達的miR-107通過靶向調控VEGFA表達，在人類多種疾病的發生、發展中起重要作用[13-16]。本研究通過RT-qPCR檢測了miR-107在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達情況，發現卵巢癌組織中miR-107的表達顯著低于正常卵巢組織，臨床病理參數分析顯示miR-107的表達水平與卵巢癌患者臨床分期及淋巴結轉移相關，且相關性分析顯示其表達量與VEGFA基因mRNA表達水平呈顯著負相關性，這與上面報道的結果相似。我們的結果表明miR-107表達減少可能通過上調VEGFA的表達來增加卵巢癌細胞的侵襲及遷移能力，從而促進卵巢癌的發生和發展。

本研究還采用ROC曲線分析了miR-107表達對卵巢癌的診斷價值，結果表明miR-107對卵巢癌的診斷準確性較高，可作為一個卵巢癌的診斷預測指標。經過分析cut-off值為1.639，其敏感度為94.6%，特異度為76.7%，考慮組織標本的不易獲得性，在今后的研究中，將進一步檢測卵巢癌患者外周血中miR-107的表達情況，進一步明確外周血中miR-107的表達水平的診斷價值。此外，我們還將在卵巢癌細胞系中進一步驗證miR-107與VEGFA的靶向關系。

綜上所述，卵巢癌組織中miR-107表達降低可能通過靶向上調VEGFA基因的表達來促進卵巢癌細胞的浸潤和轉移能力，從而在卵巢癌發生、發展中起作用。因此，進一步探索其在卵巢癌發生、發展中的分子機制，可為卵巢癌的早期診斷、預防及治療提供新思路。