EPO對低氧狀態下牙髓細胞增殖和保護的實驗研究

殷亮亮，李春年

(河北醫科大學口腔醫學院, 河北醫科大學口腔醫院牙體牙髓科,河北省口腔醫學重點實驗室,河北省口腔疾病臨床醫學研究中心，河北 石家莊 050017)

牙髓壞死主要是由牙髓缺氧造成的。細菌感染、溫度、充填材料的物理化學刺激、創傷等都會造成牙髓組織處于缺氧狀態。線粒體[1]是體內氧氣使用的主要場所，其功能障礙在缺氧性疾病的病理生理發展中起著關鍵作用。組織缺氧時，三磷酸腺苷生成減少，進而降低線粒體的呼吸功能。嚴重缺氧時線粒體可出現腫脹、嵴崩解、外膜破裂和基質外溢等病變，進而導致細胞本身及周圍組織的溶解、壞死。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)最初被認為只在調節紅細胞生成中發揮著關鍵作用[2-3]。越來越多的研究表明，EPO是DNA缺氧反應元件的關鍵基因之一，缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)可以與EPO結合并驅動其轉錄，提供組織保護。EPO信號具有多種生物學效應，如促進創傷愈合、誘導內皮細胞增殖和遷移、刺激血管生成等。此外，EPO通過抑制白細胞介素等多種促炎細胞因子的產生，具有良好的抗炎作用。由于EPO能夠促進血管生成并具有抗炎活性，推測EPO這些特征可能在牙髓修復和再生中發揮著作用。然而，到目前為止，EPO對缺氧狀態下牙髓細胞的作用還未見報道。因此，本研究通過觀察缺氧條件下EPO對牙髓細胞的作用，探討低氧狀態下牙髓細胞的增殖和保護機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取河北醫科大學口腔醫院口腔頜面外科門診因正畸需拔出的前磨牙或第三磨牙，男性10例，女性8例，年齡14～18歲，平均年齡16歲，未做過充填治療和牙髓治療，無齲壞，無根裂。

患者已簽署知情同意書，實驗已經過河北醫科大學口腔醫院醫學倫理委員會批準。

1.2實驗材料

1.2.1實驗儀器設備 細胞培養箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(Thermo Eleetron公司)；倒置相差顯微鏡(德國ZEISS公司)；Synergy-TH酶標儀(美國Biotech公司)；低溫高速離心機(美國Thermo公司)；YP2001N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；低速離心機(北京醫用離心機廠)；高壓蒸汽滅菌器(日本松下健康醫療器械株式會社)。

1.2.2實驗器材 25 cm2培養瓶，75 cm2培養瓶(ThermoFisher，美國)；6孔細胞培養板，96孔細胞培養板(美國Corning公司)。

1.2.3實驗試劑 胎牛血清，青、鏈霉素混合液，PBS磷酸鹽緩沖液(以色列BI公司)；高糖DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養液，胰蛋白酶(美國Gibico公司)CCK-8試劑盒，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase activity，ALP)試劑盒(中國碧云天生物技術研究所)；EPO(沈陽三生制藥有限責任公司)。

1.3實驗方法

1.3.1離體牙取材 牙齒拔除后自根尖部至冠部碘伏消毒3遍，高速手機和無菌水冷卻在牙頸部制備環形溝槽，不能穿髓，制備完成后將離體牙立刻置于預冷的含有1%雙抗的基礎培養基中，1 h內轉運至實驗室對牙髓組織取材，進行原代細胞培養。

1.3.2牙髓細胞培養 將收集的離體牙用含有2%雙抗(200 g/mL青霉素和200 g/mL鏈霉素)的PBS溶液清洗3遍，用技工剪沿著牙頸部預磨好的凹槽剪斷，拔髓針取出牙髓后剪去根尖區2 mm的牙髓，剩余的牙髓組織用含1%雙抗PBS溶液清洗3遍，將清洗干凈的牙髓組織用無菌眼科剪剪碎，使組織塊體積約為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，移入15 mL離心管中，加入1 mL的I型膠原酶(3 g/L)和中性蛋白酶(4 g/L),置于37 ℃，5% CO2培養箱中孵育，消化40 min，每隔15 min吹打組織塊，使組織塊與酶充分接觸，直到組織塊消化為棉絮狀，然后加入3 mL含10%FBS的培養液終止消化，并進行吹打，充分接觸。將離心機設置為1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，加入3 mL的含10%FBS的培養液重懸，將懸液接種于8 cm2培養皿中，在37 ℃，5% CO2細胞培養箱內培養。3 d更換一次培養液，細胞生長匯合至80%時，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.3牙髓細胞的傳代 在倒置顯微鏡下觀察細胞外形及細胞狀態，原代牙髓細胞生長至80%時，可進行傳代。在超凈工作臺下用1%雙抗PBS蕩洗培養皿3遍,清洗力度要輕柔，防止細胞損傷。然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，溶液量要達到與培養皿底細胞充分接觸，在37 ℃恒溫培養箱孵育2 min，在顯微鏡下及時觀察，當貼壁細胞趨于圓形、細胞開始少量飄起時，加入2～3倍胰蛋白酶溶液體積的完全培養基終止消化。用巴氏吸管將皿底的細胞充分吹打，使細胞從皿底脫壁，移入離心管中，將離心機設置為1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，加入3 mL含10% FBS的培養液重懸，按1∶2或1∶3進行傳代，加入適量培養液，混勻后于37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h后換液，之后每3 d換液，牙髓細胞生長至80%時，進行下一次傳代。

1.3.4牙髓細胞的凍存 取正常生長并增殖至80%的牙髓細胞，PBS清洗3遍，消化離心后獲得細胞團塊，加入4℃預冷的細胞凍存液(配置方法：10% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、30%胎牛血清、60% 高糖培養基，現配，細胞計數，將細胞密度調整為(1～3)×106個/mL，細胞懸液分裝成每管1 mL至凍存管，在凍存管上標明細胞名稱、細胞代數、時間及操作者。凍存步驟為4 ℃、30 min，-20 ℃、60 min，-80 ℃過夜然后轉移至液氮罐中進行長期保存。凍存后1周取一管進行復蘇，檢測細胞凍存效果，以便進行后續試驗。

1.3.5牙髓細胞的復蘇 從液氮容器中取出凍存管，在37 ℃恒溫水浴箱中浸泡，并不斷搖動使其盡快融化。從37 ℃水浴中取出凍存管，吸出細胞懸液，移入離心管中并加入10倍以上培養液，混勻，離心5 min，棄上清，加入含10%FBS培養液重懸細胞并計數，調整細胞密度，接種于培養皿中，放入37 ℃培養箱中培養，24 h細胞貼壁后更換培養液，之后每3 d換液，繼續培養。

1.3.6CCK-8法檢測EPO在低氧狀態下對牙髓細胞增殖的影響 ①選用第4代生長狀態良好的牙髓細胞，0.25%胰蛋白酶消化后制取細胞懸液，以2×104個/mL密度接種至96孔板內，每孔200 μL，24 h細胞貼壁后，吸去孔中培養液，用PBS清洗3遍。②實驗分為實驗組和對照組。實驗組中在貼壁細胞孔內加入200 μL含有濃度為20 U/mL EPO的完全培養液，對照組中在貼壁細胞孔內加入200 μL僅含10%FBS的高糖DMEM培養液。③將培養箱氧氣濃度調至1%，分別培養24 h、48 h、72 h后，棄去孔內的培養液，PBS清洗3遍后每孔加入100 μL培養液和10 μL CCK-8溶液，培養箱內孵育2～4 h，用酶標儀檢測各孔450 nm波長的OD值。

1.3.7ALP檢測EPO在低氧狀態下對牙髓細胞分化的影響 ①選用第4代生長狀態良好的牙髓細胞，0.25%胰蛋白酶消化后制取細胞懸液，以2×104個/mL密度接種至96孔板內，每孔200 μL，24 h細胞貼壁后，吸去孔中培養液，用PBS清洗3遍。②實驗分為實驗組和對照組。實驗組中在貼壁細胞孔內加入200 μL含有濃度為20 U/mL EPO的完全培養液，對照組中在貼壁細胞孔內加入200 μL僅含10%FBS的高糖DMEM培養液。③將培養箱氧氣濃度調至1%，分別培養24 h、48 h、72 h后，棄去孔內的培養液，PBS清洗3遍后加入250 μL/孔RIPA裂解液，同時反復吹打，提取細胞蛋白。根據ALP試劑盒說明書，按照不同分組分別將蛋白樣品加入96孔板內，每孔30 μL，再分別加入基質液和緩沖液各50 μL，37 ℃孵育15 min，加入顯色劑150 μL，酶標儀檢測在520 nm波長下的吸光度值。

1.4統計學方法 應用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。相同實驗條件下重復3次，計量資料比較采用重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1牙髓細胞形態 倒置顯微鏡下觀察發現，用改良組織塊酶消化法進行原代牙髓細胞培養，原代培養第3天，可見牙髓細胞從組織塊邊緣爬出，成放射狀，原代細胞培養14 d左右基本長滿，細胞呈長梭形，纖維狀。細胞數量較多時呈放射狀或旋渦狀，生長匯合至80%時可進行傳代。見圖1～4。

圖1 人牙髓細胞原代培養第3天(倒置顯微鏡 ×200)

2.2低氧狀態下EPO對牙髓細胞增殖和分化的作用 低氧狀態下在濃度為20 U/mL的EPO分別作用于牙髓細胞24 h、48 h、72 h后，在酶標儀上測定450 nm波長下各孔的吸光度值，結果顯示：各時間點的吸光度值實驗組均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；在酶標儀測定520 nm波長下各孔的吸光度值，結果顯示：在24 h、48 h、72 h吸光度實驗組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 低氧狀態下EPO對牙髓細胞增殖及分化的作用Table 1 Effect of EPO on dental pulp cell proliferation and differentiation under hypoxic condition

3 討 論

研究表明，缺氧直接影響MALAT1基因的轉錄。MALAT1通過缺氧控制著內皮細胞的表型轉變，抑制內皮細胞的增殖。此外，缺氧可誘導MiR-140-5p抑制細胞，降低細胞活力，加速細胞損傷和凋亡。缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)[4-6]途徑在缺氧反應中也起著重要作用，在缺氧條件下，HIF-1α進入細胞核，與其亞基結合形成HIF-1，并與其他蛋白一起結合到miR-210[7]，引起缺氧反應相關基因的表達，進而導致細胞本身及其周圍組織的溶解、壞死。而缺氧誘導基因的表達對EPO基因表達起著重要作用，缺氧誘導的核因子通過蛋白合成與EPO基因結合，從而促進EPO基因的轉錄激活。研究已表明，EPO及受體在炎癥的牙髓組織中也會高度表達。當細胞缺氧時，EPO可以調節干細胞功能，保護組織，減少損傷并促進組織功能的恢復[8]。有學者指出，EPO以劑量依賴性方式影響著細胞生長，當EPO濃度為20 U/mL時，細胞表現出最大的活性。因此，本研究觀察低氧狀態下對牙髓細胞保護的EPO濃度設定為20 U/mL，結果顯示：無論在第24 h、48 h、72 h時實驗組和對照組吸光度值，差異有統計學意義，說明適當濃度的EPO在低氧狀態下能促進牙髓細胞的增殖，對低氧狀態下的牙髓細胞有一定的保護作用。基質細胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是一種具有趨化活性的細胞因子，CXCR4是其唯一受體。在牙髓損傷修復過程中，SDF-1/CXCR4軸起著關鍵作用。研究也表明，EPO可以通過SDF-1調控間充質干細胞的生長和遷移。EPO誘導牙髓細胞后能顯著上調趨化因子CXCR4且SDF-1mRNA的表達水平，提示在缺氧狀態下EPO可能通過SDF-1/CXCR4軸促進牙髓細胞的增殖。

EPO除了調節紅細胞的生成外還具有多種生物學功能，但EPO對成骨分化的作用仍存在爭議。有研究發現，EPO可以通過激活細胞微環境中的骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)釋放來增強破骨細胞的形成。此外，EPO已顯示在體外能夠刺激間充質基質細胞向成骨細胞的分化[9-11]，并增加了骨骼成骨細胞的形成和體內成骨細胞的數量[12]，EPO在組織損傷時，也可以通過促進內皮細胞[13]趨化，將其募集到損傷部位，參與新生血管形成[14]，并促進細胞的分化表現出更高的ALP活性，加快組織損傷修復。Runx2是負責激活成骨細胞分化標記基因，骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)參與控制礦化過程，出現在分化的后期，其特征是成熟成骨細胞系的細胞。此外，osterix(也稱為Sp7)是一種新型的含鋅的成骨細胞特異性轉錄因子，對細胞的分化，增殖和骨形成至關重要。EPO調節許多成骨因子的表達，包括Runx2、骨連接蛋白、骨橋蛋白、骨鈣素和ALP。Runx2、OCN和Osterix與間充質干細胞分化的多個步驟密切相關。EPO可以上調Runx2、OCN和Osterix在基因和蛋白質水平。同時EPO可以上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[15]的表達，而VEGF的表達水平與牙髓間充質干細胞分化和修復性牙本質形成有關。本實驗在低氧狀態下以20 U/mL的EPO作為實驗組作用于牙髓細胞，ALP結果顯示：在24 h、48 h、72 h時，實驗組吸光度與對照組差異無統計學意義。分析其原因可能是與藥物作用時間太短、選擇組數太少有關，使EPO對牙髓細胞分化作用不明顯，有待于今后進一步的研究。

EPO是一種具有抗炎、抗細胞凋亡、抗氧化等多種生物學效應的細胞因子，在低氧環境下可誘導牙髓細胞EPO的表達，從而提高牙髓細胞對低氧的耐受力，減輕牙髓組織的損傷。因此，將EPO用于缺氧狀態下保護牙髓細胞具有廣闊的前景。