N-乙酰半胱氨酸對(duì)PM2.5致大鼠睪丸毒性的保護(hù)作用

田 碩，張 寧，牛 姝，李 珅，蘇 力，平 芬*

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011; 2.河北省人民醫(yī)院老年病三科，河北 石家莊 050051;3.河北省石家莊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050011)

隨著城市化和經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)，近年來(lái)我國(guó)面臨著空氣污染的重大挑戰(zhàn)。研究顯示，接觸細(xì)顆粒物會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量和質(zhì)量下降[1],與其產(chǎn)生的大量活性氧有關(guān)，活性氧會(huì)引起生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激，觸發(fā)一系列的病理過程，包括炎癥、凋亡和增殖[2]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作為一種重要的羥基自由基的重要清除劑，參與調(diào)節(jié)精液質(zhì)量和睪丸形態(tài)過程中的細(xì)胞內(nèi)氧化還原效應(yīng)，但是證明NAC干預(yù)減弱大氣細(xì)顆粒物(particulate matter,PM)2.5對(duì)生殖系統(tǒng)的負(fù)作用的研究較少。因此，本研究側(cè)重于抗氧化劑NAC對(duì)PM2.5致生殖系統(tǒng)毒性的改善作用，以及是否防止睪丸細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠(120～150 g)由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物安置在恒溫、恒濕的房間中，并保持一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的12 h光/暗循環(huán)，適應(yīng)周期為1周，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案是按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2PM2.5懸液配制 細(xì)顆粒物PM2.5是由石家莊環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提供的纖維濾膜，其利用24 h高流量采樣器(ThermoScientific TEOM1405，美國(guó))收集，采樣器位于石家莊主干道，周邊沒有大的工廠，但交通繁忙，具有城市環(huán)境特色，將PM2.5過濾膜切割成1 cm×2 cm矩形條狀，浸入去離子水中，然后用超聲波清洗機(jī)(KQ-400KDB型，中國(guó))進(jìn)行5×30 min的震蕩，然后利用八層無(wú)菌紗布過濾溶液，細(xì)顆粒懸浮液進(jìn)行真空冷凍干燥，然后于-20 ℃冷凍保存。PM2.5顆粒的直徑測(cè)量以及多分散系數(shù)(polymer dispersity index，PDI)、Zeta電位由河北醫(yī)科大學(xué)提供技術(shù)支持，使用ZetasizerNanoZS90(Malvern儀器，英國(guó))測(cè)量。其中PDI參數(shù)是衡量納米粒子分散均勻性的重要指標(biāo)，PDI數(shù)值越接近0.10，說(shuō)明粒徑分布集中，PDI數(shù)值越接近1，說(shuō)明總體粒子直徑分布不均勻，存在過大及過小顆粒。Zeta電位是反映納米顆粒在貯存條件下物理化學(xué)穩(wěn)定性的重要參數(shù)，所有納米粒子的Zeta電位均記錄為負(fù)值，Zeta電位絕對(duì)值越高，說(shuō)明納米顆粒體系越穩(wěn)定。同時(shí)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(ELANDRCII，PE，美國(guó))對(duì)PM2.5樣品中重金屬進(jìn)行定量分析。

1.3PM2.5染毒大鼠模型建立 30只大鼠隨機(jī)分為3組，分為生理鹽水對(duì)照組、PM2.5暴露組、PM2.5+NAC組。PM2.5染毒方式通過氣管滴注法，每周染毒1次，共2個(gè)月；NAC組在PM2.5染毒的基礎(chǔ)上，通過灌胃方式連續(xù)給予150 mg·kg-1·d-1NAC；生理鹽水對(duì)照組給予相同容量生理鹽水。

1.4睪酮測(cè)定 造模后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，采用腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，離心取上清備用，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清中睪酮含量。

1.5睪丸炎性及氧化指標(biāo)檢測(cè) 采血后，迅速剝離一側(cè)睪丸，置入提前預(yù)冷的生理鹽水中，手工勻漿,4 ℃下,3 000 r/min離心15 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)指標(biāo)情況，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)指標(biāo)水平。

1.6大鼠睪丸組織病理切片染色 睪丸固定在4%多聚甲醛中，脫水，石蠟包埋，每個(gè)組織塊切成4 μm厚，用蘇木精和伊紅染色，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。在100倍放大鏡下，對(duì)每只大鼠的睪丸組織切片進(jìn)行觀察，以觀察生精小管中可能發(fā)生的任何組織學(xué)改變，如生殖細(xì)胞的脫落、生精小管結(jié)構(gòu)破壞、多核巨細(xì)胞的存在或生殖細(xì)胞的丟失。

1.7大鼠肺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 在4 μm厚的石蠟包埋切片上進(jìn)行TUNEL染色，利用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche，Mannheim，德國(guó))說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在放大倍數(shù)為200的顯微鏡視野下觀察凋亡細(xì)胞，并對(duì)每個(gè)切片的10個(gè)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)。 最后所有圖像均采用倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)放大100倍進(jìn)行采圖。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PM2.5理化性質(zhì) 馬爾文Zeta納米分析儀顯示，從石家莊市非工業(yè)區(qū)收集到的冬季PM2.5，PM2.5直徑122～178 μm，PM2.5懸浮液的PDI<0.47，則表明樣品均勻分散。PM2.5的zeta電位為-29.65 mV，表明PM2.5懸浮液具有良好的穩(wěn)定性，綜上，收集的PM2.5樣品具有粒徑小、均勻一致，且穩(wěn)定性好特點(diǎn)。 PM2.5毒性主要取決于其化學(xué)成分，PM2.5樣品中七種重金屬的濃度，包括致癌物質(zhì)As、Cd、Cr、Ni和非致癌物質(zhì)Pb、Hg、Mn，見表1。

表1 PM2.5混懸液重金屬含量測(cè)定Table 1 Measurement of heavy metal content in the PM2.5 suspension (μg/g)

2.2大鼠血清睪酮及睪丸MDA、GSH、SOD、IL-10含量 PM2.5暴露組和PM2.5+NAC組大鼠血清睪酮水平及睪丸組織GSH、SOD、IL-10水平均低于鹽水對(duì)照組,睪丸組織MDA水平升高，PM2.5+NAC組睪酮水平及睪丸組織GSH、SOD、IL-10水平高于PM2.5組,睪丸組織MDA水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清睪酮及睪丸MDA、GSH、SOD、IL-10含量Table 2 Content of serum testosterone,MDA,GSH,SOD,and IL-10 in testicular tissue of rats in each group

2.3大鼠睪丸組織HE染色 鹽水對(duì)照組睪丸組織形態(tài)無(wú)異常改變，曲細(xì)精管排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)正常，官腔內(nèi)有大量精子細(xì)胞；PM2.5暴露組細(xì)胞類型無(wú)法識(shí)別，細(xì)胞核染色度過高，小管直徑減小，生精細(xì)胞急劇減少，生精細(xì)胞向管腔脫離和脫落；NAC減輕了PM2.5誘導(dǎo)的睪丸組織病理學(xué)損傷。見圖 1。

圖1 睪丸組織病理表現(xiàn)(HE ×200)

2.4睪丸細(xì)胞凋亡情況 在PM2.5暴露組中，曲精小管中多個(gè)細(xì)胞核表現(xiàn)出明顯的深棕色染色，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)明顯高于鹽水對(duì)照組和PM2.5+NAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而PM2.5+NAC組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于PM2.5組，但高于鹽水對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PM2.5暴露組和PM2.5+NAC組睪丸細(xì)胞凋亡指數(shù)高于鹽水對(duì)照組，PM2.5+NAC組低于PM2.5暴露組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 各組大鼠睪丸細(xì)胞凋亡指數(shù)分析Table 3 Apoptosis index analysis of rat testicle cells in each group

3 討 論

眾所周知，大氣污染是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及大氣中不同的污染物。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2013年10月17日宣布，室外空氣污染被歸類為一種致癌物質(zhì)，PM是室外空氣污染的主要成分，也被歸類為致癌物。根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)直徑和通過呼吸道吸入能力，PM分為三類，PM2.5被認(rèn)為是最具代表性的空氣污染物[3]。PM2.5是一種復(fù)雜的混合物，通過強(qiáng)的積累效應(yīng)，成為各種有害物質(zhì)的載體，如多環(huán)芳烴、硫酸鹽、硝酸鹽、銨、部分離子水、無(wú)機(jī)離子和有機(jī)元素碳[4]。研究亦證實(shí)硝酸萃取的PM2.5重金屬成分，是通過相對(duì)較弱的靜電形式吸附于細(xì)顆粒物表面，而且重金屬顯示出比細(xì)顆粒物表面其他有毒成分更高的生物利用度，換言之，其更容易被外界環(huán)境中更多的食物或者物體所吸收，沉積于物質(zhì)表面，通過離子交換進(jìn)入物質(zhì)深部，一旦人體攝入，進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列的惡性疾病。通過對(duì)PM2.5的分析，科學(xué)家已確定PM2.5可以誘發(fā)氧化應(yīng)激[5]，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，從而使細(xì)胞功能失調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同樣，本研究結(jié)果證實(shí)了PM2.5暴露誘導(dǎo)的生殖毒理學(xué)作用。

不孕癥已成為全球公共衛(wèi)生的威脅，據(jù)估計(jì)影響到全世界8%～12%的育齡夫婦， 男性因素被認(rèn)為超過50%。中國(guó)不孕癥流行病學(xué)研究表明，河北省約17.2%的育齡夫婦患有不孕癥[6]，多項(xiàng)研究證明可能與空氣重污染水平有關(guān)[7]。開展PM2.5不同暴露水平的研究對(duì)于居住在PM2.5污染嚴(yán)重地區(qū)的人口是有意義的。本研究結(jié)果顯示PM2.5可以導(dǎo)致睪丸生精細(xì)胞數(shù)量減少，生精微環(huán)境穩(wěn)定性受到破壞，降低血漿中睪酮水平，誘發(fā)氧化應(yīng)激和凋亡，而NAC可以減輕PM2.5對(duì)睪丸的損傷程度，可以改善大鼠抗氧化、抗炎能力，減少睪酮指標(biāo)下降。

睪丸是最重要的雄性生殖腺之一，它產(chǎn)生配子并分泌激素，主要是睪酮。男性95%以上睪酮含是由位于睪丸中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的。精子發(fā)生主要由睪酮調(diào)節(jié)[8]，研究證實(shí)PM2.5致精子數(shù)量的減少，與睪丸生殖細(xì)胞的減少是平行的，睪酮減少可能是睪丸間質(zhì)細(xì)胞損害的指標(biāo)[9]。研究顯示睪酮激素水平的下降，可能與睪丸睪酮合成酶，包括P450scc、17βHSD、StAR的表達(dá)降低有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，氣管內(nèi)灌注PM2.5擾亂精子發(fā)生的各個(gè)階段，破壞基底膜和固有膜，減少生殖細(xì)胞數(shù)量，而且PM2.5染毒大鼠循環(huán)睪酮下降。本研究結(jié)果與先前的動(dòng)物研究結(jié)果是一致的[11]。

睪丸細(xì)胞和精子容易受到自由基的氧化損傷，因?yàn)槠滟|(zhì)膜中含有豐富的多不飽和脂肪酸，而細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化可能最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。本研究結(jié)果顯示睪丸結(jié)構(gòu)異常，包括生殖細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞，PM2.5染毒大鼠中MDA指標(biāo)明顯升高，可能與PM2.5致睪丸質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸的過氧化作用有關(guān)。

氧化應(yīng)激是由于活性氧生成與清除之間的不平衡導(dǎo)致，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞成分的氧化損傷，改變?cè)S多細(xì)胞功能，包括各種酶活性的喪失。抗氧化酶是對(duì)抗活性氧的重要組成部分，SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，谷胱甘肽在保護(hù)細(xì)胞免受活性氧(如H2O2)和抗氧化活性的影響方面非常重要，谷胱甘肽還可以減少脂質(zhì)過氧化。本研究結(jié)果顯示，SOD和GSH活性下降，可能是由于PM2.5導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷睪丸細(xì)胞，進(jìn)而使酶合成減少或者活性氧直接導(dǎo)致酶活性下降。NAC作為有效的抗氧化劑[12]，PM2.5+NAC組中SOD、GSH活性較PM2.5組明顯升高，表明NAC可以減少睪丸細(xì)胞損傷，提高抗氧化酶活性。另外在氧化應(yīng)激過程中，谷胱甘肽濃度降低，NAC迅速影響水解和合成谷胱甘肽的γ-谷氨酰半胱氨酸和GSH合成酶，增加谷胱甘肽水平。

正常的生理情況下，細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，PM2.5導(dǎo)致睪丸氧化應(yīng)激，引發(fā)細(xì)胞毒效應(yīng)，從而誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡，這可能涉及FAS、FASL和Bax[13]。但是PM2.5介導(dǎo)的睪丸細(xì)胞凋亡具體機(jī)制尚不清楚。有研究顯示，NAC抑制凋亡前基因的表達(dá)，此外，NAC還能抑制前炎癥和抗凋亡基因活性，如c-Jun N端激酶、MAP激酶p38、SAPK/INK、c-fos通路和核因子κB[14]。研究表明，NAC能夠抑制壬基酚引起的睪丸氧化應(yīng)激、睪丸組織凋亡、萎縮和退化的影響[15]。

綜上所述，NAC作為一種有效的抗氧化劑，通過加強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)和防止氧化應(yīng)激，對(duì)PM2.5引起的睪丸損傷具有潛在的保護(hù)作用，建議利用NAC治療和預(yù)防雄性生殖系統(tǒng)PM2.5中毒。