增強自噬水平對腦缺血預處理神經保護機制的影響

孫 原，侯曉冬，楊延雯，李艷玲，李 弘，石秋艷

(1.華北理工大學附屬醫院神經內科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市人民醫院病案科，河北 唐山 063001)

缺血預處理(ischemic preconditioning)是器官的短期缺血適應，可以在永久性缺血壞死之前起到保護作用，但完整的分子機制仍不明確[1]。據報道，氧化應激反應、線粒體損傷和細胞凋亡激活在缺血預處理后均被抑制。近年來有研究提出，自噬也許參與了缺血預處理的重要環節來減輕神經損傷[2]。本研究通過制作大鼠缺血再灌注模型，并對部分大鼠事先進行缺血預處理，探索自噬在大鼠腦缺再灌注損傷中的具體作用及可能的分子機制。進一步為腦缺血的防治提供可能策略。報告如下。

1 材料與方法

1.1動物實驗的設計 選擇中國解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所的Sprague-Dawley雄性大鼠(8～9周齡，0.23～0.27 kg)。實驗前大鼠處于12/12 h明/暗周期，并維持40%～60%相對濕度、(23±2)℃溫度，保證實驗動物獲得標準嚙齒動物飼料和自來水。依照《實驗動物護理和使用指南》進行所有動物實驗。將100只大鼠隨機分為假手術組(A組)、缺血再灌注組(B組)，缺血預處理組(C組)，缺血再灌注+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)組(D組)，缺血預處理+3-MA組(E組)，每組20只。2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉實驗動物，并為保持其體溫在37 ℃，將其置于加熱墊上。

1.2試劑 TTC染色液(上海信帆生物科技有限公司)，3-MA(Sigma，美國)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物)，磷酸鹽緩沖液(PBS，賽默飛公司，美國)，兔抗鼠 Beclin-1、兔抗鼠LC3-Ⅱ(Cell Signaling，美國)，GAPDH(Kangchen，美國)，Western blot 發光試劑盒(Millipore，美國)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1缺血再灌注及缺血預處理模型的建立 腦缺血再灌注模型：使用Longa線栓法[3]以尼龍線栓(型號:2634-A4,北京西濃科技有限公司,中國)阻斷大鼠右側大腦中動脈血流供應，2 h后拉出恢復正常血流供應。缺血預處理模型：按照上述方法，用線栓阻斷右側大腦中動脈10 min后拔出，恢復血流20 min，并重復3次，24 h后繼續制作缺血再灌注模型。假手術組只接受相同的麻醉和頸動脈剝離過程，不阻斷大腦血流供應。大鼠腦缺血再灌注模型建立成功后，將0.5 mg 3-MA加入500 mL生理鹽水中，制備1 mg/L濃度3-MA溶液，向D、E組大鼠側腦室注射7.5 μg 3-MA溶液，A、B、C組注射等量生理鹽水。

1.3.2神經功能障礙評分 所有大鼠腦缺血再灌注后24 h評估神經功能障礙評分：0分，無神經功能障礙；1分，不能完全伸展左前肢；2分，爬行時左側轉圈；3分，爬行時向左側傾倒；4分，無自主活動能力及意識障礙。

其中B組死亡2只， D組死亡1只(蛛網膜下腔出血)，死亡與應用3-MA無關。上述死亡實驗動物均不納入實驗數據，并隨機補足實驗動物，保證每組20只。

1.3.3腦梗死體積的檢測 大鼠采用4%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，迅速取出腦，去掉嗅球及后腦，從額極開始切取4張冠狀腦片，厚約1.5 mm，立刻置于2% TTC溶液(pH值7.4，0.01 mol/L磷酸緩沖液配制)中，37 ℃避光孵育30 min。然后用10%多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死區呈現白色，非梗死區呈現紅色。應用使用光學顯微鏡(BX-51/DP-72)高清晰度彩色病理圖文報告分析系統測出各區腦梗塞面積，根據公式V=t(A1+……+An)-(A1+An)t/2，算出梗死體積。其中t為切片厚度，A為梗死面積。

1.3.4免疫組織化學法檢測自噬標志物 LC3-Ⅱ及Beclin-1水平 取右側海馬組織，制備腦組織切片(2 mm)，經二甲苯脫蠟，再由乙醇水化至水。用10%正常馬血清阻斷PBS后，應用兔抗大鼠LC3-Ⅱ和Beclin-1的多克隆抗體，并在恒溫4 ℃下過夜。然后調整溫度為37 ℃，用山羊抗兔抗體孵育15 min，滴入辣根過氧化物酶標記，應用濃縮型DAB試劑盒染色，充分顯色后封片。

每只大鼠隨機選取4張切片,使用光學顯微鏡(BX-51/DP-72，Olympus)查看神經細胞的形態學變化，每張切片隨機觀察5個視野，計數LC3-Ⅱ及Beclin-1陽性細胞(陽性細胞會被染色成灰色)，取平均值。

1.3.5細胞凋亡檢測 取右側海馬組織切片(2 mm)遵按照制造商(德國曼海姆羅氏診斷公司)的方案，采用末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)法標記凋亡的神經細胞。在光學顯微鏡400倍放大的條件下，連續選擇10個區域，每個區域至少包含500個細胞。計算TUNEL染色陽性細胞占比(%)=TUNEL染色陽性細胞數/總細胞核數量×100%。

1.4統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組腦梗死體積和神經功能障礙評分測定結果比較 A組腦梗死體積和神經功能障礙評分均為0；C組腦梗死體積和神經功能障礙評分小于B組；D組腦梗死體積和神經功能障礙評分大于B組，小于C組；E組腦梗死體積和神經功能障礙評分大于C組，小于D組，差異有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積和神經功能障礙評分比較 Table 1 Comparison of cerebral infarct volume and neurological dysfunction scores of rats in each group

2.2各組腦組織病理形態變化 在光學顯微鏡下觀察神經元：A組數量多，形態完整；其余4組數量少，形態破壞，細胞核破裂、固縮，其中最為嚴重的是B組和C組，D組和E組神經元數量較B組和C組增多，細胞水腫及細胞核損傷減輕(圖1)。

2.3各組右側海馬組織Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細胞數比較 A組Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細胞表達少見；4組Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細胞表達多。C組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細胞數大于B組，TUNEL染色陽性細胞數小于B組；D組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細胞數及TUNEL染色陽性細胞數小于B組和C組，TUNEL染色陽性細胞數大于B組和C組；E組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細胞數小于C組，TUNEL染色陽性細胞數小于D組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2～4，表2。

表2 各組右側海馬組織Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細胞數比較Table 2 Comparison of Beclin-1,LC3-Ⅱ and TUNEL staining-positive cells in the right hippocampus of each group

3 討 論

目前已有許多研究指出腦缺血預處理可以一定程度上減輕后續的腦梗死損傷，但其機制仍需進一步研究[4-5]。缺血預處理是在隨后長期的或致命性的缺血損傷之前，事先對靶器官進行一次或多次短暫性缺血適應，從而達到保護器官損傷的一種方法，包括大腦、心臟、腎臟等器官都可從中受益[6]。但缺血預處理保護靶器官的分子機制尚不完全清楚。有研究報道，缺血預處理可以抑制氧化應激反應、線粒體失序和細胞凋亡[7]。同時，近年來有多種證據證實適度的自噬可能是缺血預處理發揮作用的重要調節劑[8-9]。LC3-Ⅱ水平一定程度上反映了細胞自噬的程度和自噬體的含量[10],缺血預處理的促進自噬作用主要是通過LC3-Ⅱ表達增強來實現的[11]。更有研究提出，缺血預處理在再灌注期間可被自噬抑制劑3-MA明顯削弱其神經保護作用[12]。

值得注意的是，能量傳感器腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)可能是缺血預處理對自噬調節的重要協調器[13-15]。有研究證實，缺血預處理可以激活AMPK磷酸化，啟動細胞自噬，抑制神經細胞凋亡，縮小腦梗死體積，起到神經保護作用；而當使用AMPK抑制劑時，幾乎完全使缺血預處理的神經保護作用喪失[16]。但也有報道提示自噬的誘導劑雷帕霉素也可減輕腦損傷[17]。這一系列實驗表明，自噬的確是缺血預處理發揮神經保護作用的一種重要途徑，并且為腦梗死的治療提供潛在的策略。

但是，有學者提出相反的觀點，認為在復雜的自噬信號級聯反應中，Beclin-1具有調節自噬表達的作用，是誘發腦梗死自噬或細胞凋亡的關鍵點，若降低腦梗死自噬水平，可減少神經元凋亡；敲除小鼠Beclin-1基因后，可顯著減少同側丘腦組織中雙膜自噬體的形成，并伴有TUNEL陽性凋亡神經元的明顯減少[18]。表明通過抑制自噬水平可保護神經元在缺血缺氧條件下免受損傷。

自噬與多種細胞內生物學過程相互作用，包括氧自由基積累、線粒體功能障礙、內質網應激等，影響細胞活性[19]。研究自噬途徑在缺血性腦卒中的作用和調節機制越來越引起人們的興趣，部分原因是自噬可以在應激條件下減少細胞損傷；學術界尚未就自噬在缺血性腦卒中的確切作用達成共識。目前普遍認為，腦梗死激活的自噬對神經元的存活有利有弊。但是,由于實驗設計內容繁雜，且具有異質性，包括研究對象、年齡、細胞/動物模型、腦組織缺血持續時間的差異等，都會導致實驗結果的差異。目前認為，適度的自噬可通過克服各種應激刺激，增加細胞的生存能力。但是長時間缺血導致的過度自噬對神經元是致命性的打擊[20]。因此可以推測，適度的自噬反應可以通過腦血管短暫的缺血預處理激活，從而在缺血性腦卒中發生時，神經元的損傷明顯減輕。

綜上所述，腦缺血預處理可以起到神經保護作用，以適度激活自噬系統的方式來抑制神經元凋亡。而腦缺血預處理的時間及強度可能是影響缺血性腦卒中神經元自噬的重要因素，還需要進一步研究。