一種國產(chǎn)PD-L1診斷試劑盒與進口同類產(chǎn)品的臨床一致性比對研究

杭紅，任麗娜，施麗君

(上海藥明奧測醫(yī)療科技有限公司，上海 200125)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是非常常見的婦科惡性腫瘤之一，我國CC發(fā)病率高居世界第2位，每年新發(fā)病例在10萬人以上，死亡病例約3萬人，極大威脅著女性的健康[1]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus， HPV)感染是CC發(fā)病的主要原因。目前，CC的治療方法包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療以及免疫治療。傳統(tǒng)治療方式對早期CC的治療效果較好，5年生存率可達91.5%，但對轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性CC的療效十分有限[2]。免疫治療通過刺激機體免疫系統(tǒng)提高其抗腫瘤免疫效應(yīng)，已逐步成為CC治療的新模式。

腫瘤免疫治療成為當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點，其中以PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑的研究和應(yīng)用為熱點。PD-1是自凋亡的T細胞中發(fā)現(xiàn)的一種免疫抑制性受體，其主要配體為PD-L1，兩者結(jié)合傳導(dǎo)免疫抑制信號，導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視和免疫殺傷[3]。PD-1/PD-L1抑制劑可以阻斷兩者的結(jié)合，阻斷負向調(diào)控信號，使T細胞恢復(fù)活性，從而增強機體的免疫應(yīng)答[4]。目前已有8款與PD-1/PD-L1相關(guān)的抗體藥物在國內(nèi)上市，適應(yīng)癥主要為黑色素瘤、肺癌、淋巴癌等。同時，國際上已有多款PD-1/PD-L1藥物的伴隨診斷產(chǎn)品上市[5-7]，作為相應(yīng)適應(yīng)癥的用藥指導(dǎo)。不同試劑盒所用抗體、檢測平臺、評價方法以及相應(yīng)的陽性閾值均不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果存在一定差異[8-11]。相較于國際市場，國內(nèi)目前僅有3款進口PD-L1檢測試劑盒獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準[12-13]。本研究自主開發(fā)了PD-L1(WD160)診斷試劑盒，通過與獲批的PD-L1(22C3)試劑盒在CC組織樣本中進行免疫組織化學(xué)染色比較，探究兩種診斷試劑結(jié)果的一致性，并檢測PD-L1在CC不同階段的表達情況。

1 材料與方法

1.1 抗PD-L1單克隆抗體的制備抗PD-L1單克隆抗體制備的詳細信息參見中國國家發(fā)明專利(專利號：CN109627338A；專利公布日：2019年4月16日)。以人PD-L1蛋白片段作為抗原，采用皮下注射方法免疫BALB/c小鼠，免疫2次后取血以梯度稀釋ELISA測定血清抗體效價。選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合和篩選，獲得單克隆細胞株WD160。通過WD160細胞上清液的制備和純化，得到抗PD-L1單克隆抗體。在完成PD-L1(WD160)抗體的免疫組化驗證后，從雜交瘤細胞中分離總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)特異性引物擴增VH、VL、CH和CL抗體片段，分別克隆至標準克隆載體中進行DNA測序。

1.2 臨床研究對象收集2019年5月—2020年7月于河南省腫瘤醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院和中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(浙江省腫瘤醫(yī)院)就診的有明確病理診斷的1 010例CC患者樣本。除納入臨床上經(jīng)H-E染色病理診斷為CC的石蠟包埋組織樣本，以宮頸良性疾病41例及除CC以外腫瘤患者51例的石蠟包埋組織樣本(取自同樣3家醫(yī)院)作為對照樣本。排除采樣量不足，無法溯源或被污染的樣本。本研究已獲得3家醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.3 試劑與儀器抗PD-L1抗體試劑(克隆號WD160)和DAB染色液試劑盒，購自蘇州藥明澤康生物科技有限公司。使用方法參見其產(chǎn)品說明書。操作流程簡述：樣本于60～65 ℃烤片1～2 h，脫蠟水化后，高壓修復(fù)3 min，3%過氧化氫處理10 min；抗人PD-L1抗體(一抗)孵育30 min，用二抗試劑盒中免疫顯色試劑1孵育10 min，免疫顯色試劑2孵育30 min；DAB顯色3～5 min，DAB增強劑處理8 min，蘇木素襯染后進行脫水、透明、封片。以PD-L1檢測試劑盒為對比試劑(PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)(購自美國丹科北美有限公司)。在該公司配套的AutoStainer Link 48全自動免疫組化染色儀上染色。

1.4 研究方法本研究共納入1 102例臨床診斷為CC的手術(shù)或活檢患者、宮頸良性疾病及其他腫瘤(如舌鱗癌、乳腺癌、鼻咽癌等)患者，調(diào)取其經(jīng)診斷后剩余的石蠟包埋組織樣本，連續(xù)切片，分別用WD160和22C3染色。CC組織中PD-L1染色細胞的閱片標準如下[14]。

1.4.1 判讀標準 由具備相應(yīng)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格的兩位病理醫(yī)師分別于顯微鏡下觀察染色切片，判斷染色定位，并通過計數(shù)陽性染色的細胞數(shù)，按照公式聯(lián)合陽性分數(shù)(combined positive score， CPS)=[PD-L1陽性細胞數(shù)(腫瘤細胞+免疫細胞)/可計數(shù)腫瘤細胞總數(shù)]×100進行組織學(xué)分析，判讀PD-L1的表達情況。染色評估需在低倍、高倍鏡下觀察進行。樣本中的活/可計數(shù)腫瘤細胞總數(shù)不少于100個。以CPS=1作為陽性判斷值，CPS≥1為陽性，CPS<1為陰性。

1.4.2 CC組織PD-L1表達細胞計數(shù)時分子納入/排除標準 細胞計數(shù)時，公式中分子的計數(shù)范圍為PD-L1陽性細胞，包括腫瘤細胞和免疫細胞。其中任何染色強度的浸潤性腫瘤細胞和完整或不完整的膜染色腫瘤細胞應(yīng)納入計數(shù)，未被染色的腫瘤細胞以及只有細胞質(zhì)染色的腫瘤細胞不納入計數(shù)。癌巢內(nèi)以及相鄰基質(zhì)內(nèi)任何強度膜/質(zhì)染色的單核炎癥細胞(mononuclear inflammatory cell， MIC)、淋巴細胞(包括淋巴細胞簇)和巨噬細胞納入計數(shù)，未被染色的MIC、與宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia， CIN)相關(guān)的MIC、與包括鱗狀上皮或腺黏膜、宮頸息肉和微腺體增生在內(nèi)的良性細胞相關(guān)的MIC、與潰瘍有關(guān)的MIC以及與腫瘤無關(guān)的其他病理過程中的MIC均排除于計數(shù)外。

1.4.3 CC組織PD-L1表達細胞計數(shù)時分母納入/排除標準 細胞計數(shù)時，公式中分母的計數(shù)范圍為可計數(shù)的腫瘤細胞總數(shù)，即所有活的腫瘤細胞均納入計數(shù)，而壞死腫瘤細胞、所有種類的免疫細胞和CINⅠ～Ⅲ、良性細胞(包括鱗狀上皮或腺黏膜、宮頸息肉和微腺體增生)、基質(zhì)細胞(包括成纖維細胞)均予以排除。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理用R語言對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，繪制2×2矩陣計算兩種試劑的符合率，用Kappa檢驗計算兩種試劑的檢測一致性。檢驗水準(α)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗PD-L1抗體(WD160)的性能驗證以人PD-L1蛋白片段為抗原免疫小鼠，制備抗PD-L1單克隆抗體(WD160)。通過ELISA鑒定抗體的亞型，結(jié)果顯示W(wǎng)D160的抗體亞型為IgG1型。同時，抗體親和力檢測結(jié)果顯示，在多肽摩爾濃度為0.82 μmol/L時，WD160的親和力常數(shù)為6×10-7(mol/L)。用WD160進行免疫組化實驗，檢測PD-L1在組織中的表達。結(jié)果顯示，在扁桃體質(zhì)控組織中，PD-L1在隱窩上皮呈強陽性染色，在生發(fā)中心呈弱至中等強度的陽性染色，與相同濃度的參比PD-L1抗體丹科22C3結(jié)果一致(圖1A)。同時，在肺癌組織中，無論是強度還是定位，WD160與22C3的染色效果都非常一致(圖1B)。

注：A. 扁桃體組織的PD-L1染色；B. 肺癌組織的PD-L1染色。

2.2 目標人群臨床基本特征的描述篩選臨床上確診為CC的患者為主要研究人群，其臨床表現(xiàn)有白帶異常、陰道出血、腰痛、下肢疼痛、貧血和發(fā)熱等。CC的輔助檢查方法有HPV檢測、組織學(xué)檢查、陰道鏡檢查、影像學(xué)檢查及腫瘤標志物檢查等，目前該病確診的金標準為陰道鏡或直視下的宮頸活檢病理檢查。

研究共納入1 102例患者，年齡(51.88±11.38) 歲， 手術(shù)獲取樣本883例， 活檢樣本219例， 其中CC患者1 010例(鱗狀細胞癌788例、腺癌153例、鱗腺癌12例及其他類型CC患者57例)，宮頸良性疾病患者41例和其他類型腫瘤患者51例(表1)。

表1 研究對象基本病理特征

2.3 PD-L1在CC組織中的表達情況免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，PD-L1染色陽性細胞呈棕黃色，主要表達于CC細胞以及腫瘤間質(zhì)淋巴細胞。PD-L1在CC腫瘤細胞中染色以膜染色為主，全膜染色或半膜染色均可納入計數(shù)(圖2A)；腫瘤相關(guān)免疫細胞指的是20倍同框下，浸潤的腫瘤細胞周圍染色陽性的免疫細胞，包括巨噬細胞及淋巴細胞(圖2B)。

注：A. 腫瘤細胞的PD-L1染色；B. 腫瘤細胞周圍免疫細胞的PD-L1染色。

根據(jù)CC中PD-L1的閱片標準，1 010例CC患者中，因不符合閱片標準無法判讀的樣本為61例；在可統(tǒng)計的949例CC樣本中，PD-L1陽性表達(CPS≥1)的樣本共有773例，陽性率為81.5%; 在PD-L1表達陽性的組織樣本中，CPS不同分層的樣本分布較為均勻(表2)。

表2 PD-L1表達水平在不同CC樣本中的分布

2.4 WD160與22C3的符合率對可統(tǒng)計的949例CC樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，WD160與22C3試劑的陽性符合率為100.00%，陰性符合率為83.81%，總符合率為96.42%; 使用Kappa檢驗對兩種試劑的一致性進行統(tǒng)計，K=0.889 6，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05， 表3)。

表3 WD160和22C3的符合率計算的2×2矩陣

2.5 PD-L1分子在不同分期腫瘤組織中的表達差異共納入浙江省腫瘤醫(yī)院215例CC患者參與本次統(tǒng)計分析，因為各種原因(患者有信息不全、有治療史、CC樣本腫瘤細胞數(shù)少于100個等)有45例樣本被剔除。根據(jù)CC國際婦產(chǎn)科協(xié)會(International Federation of Gynecology and Obstetrics， FIGO)分期標準，合格的170例樣本的腫瘤分期情況如下(表4)。

表4 不同分期CC患者的PD-L1表達情況

對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期共163例PD-L1陽性患者的CPS進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示臨床Ⅰ期和Ⅱ期患者的CPS很接近，中位數(shù)分別為60和55，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.57)。而相對地，臨床Ⅲ期患者的CPS顯著降低，中位數(shù)為35，與另兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005，P=0.03，P總=0.015)。由于Ⅳ期只有2例患者，故沒有納入統(tǒng)計分析。(圖3)

注：PD-L1陽性細胞(WD160染色)在不同分期腫瘤組織(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)中的CPS統(tǒng)計箱線圖。Kruskal-Wallis秩和檢驗示3組間的P總值為0.015。

3 討論

PD-L1作為免疫治療藥物的靶點，其表達水平對篩選免疫治療獲益人群至關(guān)重要。國際上PD-L1檢測試劑盒有4種，克隆號分別為22C3、28-8、SP263和SP142。目前還沒有國產(chǎn)的PD-L1伴隨診斷試劑盒應(yīng)用于臨床診斷。WD160的研發(fā)將有助于填補這一空白。值得一提的是，北京301醫(yī)院韓為東教授在針對霍奇金淋巴瘤患者PD-1抗體聯(lián)合用藥研究的臨床試驗中，使用WD160試劑盒評估腫瘤樣本的PD-L1表達水平，作為臨床用藥的參考指標，結(jié)果表明PD-L1高表達的患者PD-1抗體聯(lián)合用藥的效果優(yōu)于單獨化療[15]。

本研究針對CC患者，以抗PD-L1(22C3)抗體試劑盒為標準，評價蘇州藥明澤康生物科技有限公司的抗PD-L1(WD160)抗體檢測質(zhì)量。使用這兩種試劑進行CC組織樣本的PD-L1免疫組織化學(xué)染色，并由專業(yè)的病理醫(yī)師判讀結(jié)果。兩種試劑的判讀標準及截止值一致，染色模式也相似，均表現(xiàn)為細胞膜染色。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，兩種試劑的陽性符合率為100.00%，陰性符合率為83.81%，總符合率為96.42%，K值為0.889 6且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明兩種試劑的檢測結(jié)果具有較高的一致性。KEYNOTE158(NCT02628067)臨床試驗中，共納入98例CC患者，其中82例為PD-L1表達陽性，即陽性率達83.7%[16]。一項僅針對中國CC人群的研究也表明，PD-L1在CC中高表達，陽性表達率可達81.30%[17]。本研究納入的、可判讀的949例CC患者的PD-L1陽性率達81.50%(表2)，說明PD-L1試劑(WD160)可有效識別CC中相應(yīng)陽性人群。PD-L1(WD160)與PD-L1(22C3)的陰性符合率為83.81%。分析染色結(jié)果不一致的34例樣本，抗體染色強度不同為主要原因。

PD-L1的高表達導(dǎo)致腫瘤局部微環(huán)境免疫監(jiān)視功能下降，促使腫瘤細胞的免疫逃逸。因此，PD-L1的表達水平對腫瘤發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后改善都有著重要影響。在非小細胞肺癌組織中PD-L1的表達水平與免疫治療效果正相關(guān)，PD-L1高表達已成為免疫治療中單藥治療的新標準[18]。本研究對170例不同腫瘤分期患者的PD-L1陽性分布進行了初步評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ、Ⅱ期患者的PD-L1陽性率沒有差別，而Ⅲ期患者的PD-L1陽性程度顯著降低(P總=0.015)。此結(jié)果與非小細胞肺癌中報道的結(jié)果存在差異，這可能與腫瘤類型不同有關(guān)。但需要指出的是，在肺癌組織的PD-L1染色情況判讀中，只考慮了腫瘤細胞的PD-L1染色，而在CC中，PD-L1的判讀標準是不但要納入腫瘤細胞的表達情況，還要考慮到腫瘤細胞周圍免疫細胞中PD-L1的表達水平，也就是整個腫瘤微環(huán)境中PD-L1的表達。究竟腫瘤細胞的PD-L1表達還是腫瘤微環(huán)境的PD-L1表達與腫瘤免疫治療更相關(guān)，這是一個值得探討的問題。PD-L1抗體藥物已被用于晚期CC患者的治療[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達在不同分期的CC中有差異，這種差異是否對CC患者的用藥有指導(dǎo)意義，還需要進一步的臨床研究。

綜上所述，PD-L1(WD160)與PD-L1(22C3)的檢測結(jié)果具有較高的一致性，可進一步作為CC免疫治療藥物的伴隨診斷試劑，有助于藥物療效相關(guān)性和有效性的臨床研究工作開展。