過(guò)敏性鼻炎機(jī)體中Th9變化及相關(guān)因子表達(dá)的研究

何瑋，梁興明，胡敏，唐軍，趙世杰，楊強(qiáng)威，藍(lán)英，林華國(guó)，文芳芳

(南寧市第二人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，南寧 530031)

過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見的慢性過(guò)敏性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是患者出現(xiàn)反復(fù)的噴嚏、鼻塞等鼻部癥狀，可引起失眠、乏力、情緒失調(diào)等，極大地影響了患者的健康及生活質(zhì)量[1]。全球AR患病率約為11%，我國(guó)AR平均患病率為10%～15%，近年來(lái)以3%～5%的速度增長(zhǎng)[2-3]。目前常用的療法有過(guò)敏原規(guī)避、抗過(guò)敏藥物治療及免疫療法等[4]。盡管圍繞AR療法的研究眾多，但該病頑固、易復(fù)發(fā)，療效仍然有限[5]。AR的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，已有研究[6]表明，IL-9+Th9及其轉(zhuǎn)錄因子與支氣管哮喘有著密切聯(lián)系，但它們?cè)贏R發(fā)病過(guò)程中的作用未得到闡明。因此，本研究擬通過(guò)臨床檢測(cè)AR患者Th9及其相關(guān)因子的表達(dá)水平，同時(shí)建立小鼠AR模型，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平上驗(yàn)證臨床檢測(cè)結(jié)果，初步探討Th9及相關(guān)細(xì)胞因子在AR發(fā)病過(guò)程中的作用，幫助更好認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2018年1月—12月于南寧市第二人民醫(yī)院就診的AR患者46例(病例組)及同期健康體檢者12例(健康組)，兩組在性別、年齡等指標(biāo)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05， 表1)，具有可比性。

表1 健康組與病例組一般情況比較

1.2 動(dòng)物與分組SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，共6只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±5) g，購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于SPF條件下飼養(yǎng)小鼠，環(huán)境溫度22 ℃～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜明暗交替12 h/12 h；小鼠自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行研究。研究將小鼠隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組(n=3)和模型組(n=3)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 試劑與儀器SYBR Green PCR試劑盒，購(gòu)自KAPA Biosystems公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；DNase Ⅰ，購(gòu)自Fermentas公司；氯仿，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；卵清蛋白(ovalbumin, OVA)和Al(OH)3，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；IL-4、IL-9和TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；抗小鼠CD4-FITC、IL-9-eFluor 660抗體， 購(gòu)自eBioscience公司。PCR 引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

CFX 96熒光定量PCR儀，來(lái)自Bio-Rad公司；iCEN-24R高速冷凍離心機(jī)，來(lái)自杭州奧盛儀器有限公司；SW-CJ-1D單人單面垂直送風(fēng)(經(jīng)濟(jì)型)凈化工作臺(tái)，來(lái)自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；NovoCyte系列流式細(xì)胞儀，來(lái)自艾森生物(杭州)有限公司。

1.4 AR模型的構(gòu)建與鑒定[7]將0.3 mg OVA及30 mg Al(OH)3溶解于1 mL生理鹽水中，腹腔注射小鼠，隔天1次，共注射14 d。第15天(Day 15, D15)用5% OVA雙側(cè)鼻腔滴注，20 μL/側(cè)， 1次/d，連續(xù)7 d。最后一次OVA滴注后30 min起，記錄小鼠撓鼻、噴嚏等癥狀發(fā)生情況，通過(guò)癥狀學(xué)評(píng)分表評(píng)估造模是否成功。使用疊加法記錄總分，總分≥5 分者即為造模成功。對(duì)照組小鼠用相同體積生理鹽水和雙蒸水代替OVA腹腔注射和滴鼻。鼻部癥狀學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下(表2)。

表2 小鼠鼻部癥狀學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 ELISA檢測(cè)患者血清IL-9、IL-4和TGF-β1水平收集兩組研究對(duì)象外周血，室溫靜置10～30 min，900×g離心10 min。用移液槍吸取上清液，于-80 ℃保存，待ELISA檢測(cè)血清樣本中IL-9、IL-4和TGF-β1水平。

1.6 小鼠PBMC及鼻黏膜組織樣本的分離獲取用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，抽取外周血，分離PBMC。去除小鼠頭部皮膚，找到鼻骨間縫，沿間縫剪開鼻骨，暴露鼻黏膜后用顯微鑷輕柔分離得到鼻黏膜組織，分別用于FACS和qPCR檢測(cè)。

1.7 小鼠鼻黏膜組織的病理學(xué)檢查處死小鼠后，將頭部置于乙醇甲醛混合固定液中固定，加入5%甲酸脫鈣，石蠟包埋、切片。按照常規(guī)步驟進(jìn)行H-E染色，鏡下觀察、攝片。

1.8 qPCR檢測(cè)各組小鼠鼻黏膜組織中PU.1、IRF-4、IL-9、IL-4和TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平用TRIzol抽提鼻黏膜組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin作為內(nèi)參，IL-9、IL-4、TGF-β1、IRF-4和PU.1 為目的基因。反應(yīng)程序：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s(持續(xù)39個(gè)循環(huán))；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列如下(表3)。

表3 qPCR引物序列

1.9 FACS檢測(cè)小鼠外周血Th9(CD4+IL-9+T)百分比取1.6中分離獲得的PBMC，用50 ng/mL聚丙烯酸甲酯、10 μg/mL離子霉素和10 μg/mL莫能霉素于37 ℃培養(yǎng)6 h，漂洗后加入抗CD4-FITC抗體及破膜液，再使用抗IL-9-eFluor 660抗體染色，F(xiàn)ACS檢測(cè)并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組對(duì)象血清中IL-9、IL-4和TGF-β1表達(dá)水平比較病例組患者血清中IL-9、IL-4和TGF-β1的表達(dá)水平高于健康組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01，表4)。

表4 兩組對(duì)象血清中IL-9、IL-4和TGF-β1表達(dá)水平的比較

2.2 兩組小鼠的鼻部癥狀學(xué)評(píng)分比較對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)噴嚏、撓鼻、流涕等癥狀(癥狀計(jì)分均為0分)；AR模型組小鼠均出現(xiàn)噴嚏、撓鼻、流涕等癥狀，平均癥狀計(jì)分總值大于5分，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表5)。

表5 兩組小鼠鼻部癥狀學(xué)評(píng)分

2.3 兩組小鼠的鼻黏膜組織病理學(xué)觀察對(duì)照組小鼠鼻黏膜組織正常，而模型組小鼠鼻黏膜組織水腫，纖毛排列紊亂，出現(xiàn)明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明AR模型構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 兩組小鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化(×400)

2.4 兩組小鼠PU.1、IRF-4、IL-9、IL-4和TGF-β1的轉(zhuǎn)錄水平比較模型組小鼠鼻黏膜組織中PU.1、IRF-4、IL-9、IL-4和TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖2)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.5 兩組小鼠外周血Th9百分比的比較模型組和對(duì)照組小鼠外周血中均有Th9存在，且模型組Th9百分比高于對(duì)照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

注：A. FACS檢測(cè)兩組小鼠外周血Th9百分比；B. 兩組小鼠外周血Th9百分比統(tǒng)計(jì)圖。與對(duì)照組比較， *P<0.05。

3 討論

CD4+T細(xì)胞在AR的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Th9是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群[8]，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，具體作用機(jī)制與組織或炎癥微環(huán)境有關(guān)[9]。Th9具有促炎作用，主要依靠分泌細(xì)胞因子IL-9發(fā)揮功能[10]。Th9的分化受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，其中IL-4、TGF-β1是Th9分化的主要調(diào)節(jié)因子[11]。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道，Th9參與了過(guò)敏性哮喘的發(fā)展，盡管其對(duì)AR的作用尚不清楚，鑒于IL-9在其他炎癥性疾病中的重要功能，筆者初步推測(cè)IL-9或Th9在AR中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，病例組的IL-9、IL-4、TGF-β1表達(dá)水平顯著高于健康組(均P<0.01)，提示IL-9、IL-4、TGF-β1在AR中發(fā)揮重要作用。

AR是一種過(guò)敏性變態(tài)反應(yīng)性疾病，其特征是變應(yīng)原暴露引起的鼻黏膜炎癥。除Th9，AR的發(fā)生發(fā)展機(jī)制還涉及其他炎癥細(xì)胞如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。另外，許多細(xì)胞因子和趨化因子也影響AR的發(fā)生發(fā)展[13]。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，OVA是用于誘導(dǎo)慢性過(guò)敏反應(yīng)的抗原，該模型已被證實(shí)可用于研究AR的機(jī)制或療法探尋。因此，本研究使用OVA構(gòu)建小鼠AR模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AR組小鼠鼻部癥狀學(xué)評(píng)分總值>5分，病理觀察結(jié)果也顯示出現(xiàn)明顯的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，證明小鼠AR模型構(gòu)建成功。PU.1和IRF-4是參與Th9分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]，本研究采用qPCR檢測(cè)PU.1、IRF-4、IL-9、IL-4和TGF-β1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR模型組小鼠鼻黏膜組織中PU.1、IRF-4、IL-9、IL-4和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)，提示這些轉(zhuǎn)錄因子在AR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。李志等[10]報(bào)道顯示，哮喘組患者外周血中Th9百分比高于對(duì)照組。本研究結(jié)果顯示，AR模型組中Th9百分比及相關(guān)因子表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，提示Th9及其相關(guān)因子參與了AR的發(fā)生發(fā)展。

綜上，Th9及其相關(guān)細(xì)胞因子在AR發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用，這有助于揭示AR的發(fā)病機(jī)制，為其潛在治療靶點(diǎn)的選擇提供依據(jù)。