駱駝奶對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎的保護(hù)作用

崔暢婉，于淼，吳思，王爽，孫崢嶸

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 生物樣本庫，沈陽 110001)

駱駝奶中含有豐富的維生素C、不飽和脂肪酸、維生素B以及牛奶中沒有的乳鐵傳遞蛋白和溶菌酶等，營養(yǎng)成分含量極高[1]。駱駝奶中含有豐富的與牛奶不同的蛋白質(zhì)，不會(huì)誘發(fā)蛋白質(zhì)過敏癥狀，對(duì)于食用牛奶過敏的人群更為安全[2]。研究表明，駱駝奶能夠通過調(diào)節(jié)Th1型和Th2型細(xì)胞比例及細(xì)胞因子分泌，糾正失衡的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，在免疫性糖尿病和肝炎等疾病治療過程中起重要的輔助治療作用[3-4]。腸黏膜免疫失衡是引起腸道損傷的重要原因之一，在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease， IBD)患者腸黏膜組織中有大量Th17浸潤，它分泌的IL-17是重要的促炎因素。CTL可直接殺傷靶細(xì)胞，在炎癥和腫瘤免疫過程中具有重要作用。中性粒細(xì)胞(CD11b+Gr1+)、Th以及NK細(xì)胞均能合成IL-10，后者抑制單核巨噬細(xì)胞的抗原提呈作用，減少巨噬細(xì)胞分泌IL-23，進(jìn)而抑制Th17免疫應(yīng)答，抑制炎癥發(fā)生。目前駱駝奶對(duì)腸道黏膜免疫細(xì)胞分群及其功能是否具有調(diào)節(jié)作用，能否抑制腸道炎癥發(fā)生尚不明確。本研究使用2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)小鼠急性腸炎模型，使用駱駝奶灌胃治療，檢測(cè)小鼠腸道淋巴細(xì)胞亞群、中性粒細(xì)胞百分比及細(xì)胞因子分泌情況，探討駱駝奶對(duì)小鼠腸炎的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑SPF級(jí)BALB/c小鼠24只，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量16～18 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。駱駝奶粉，購自新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司；TNBS溶液(2 mg粉末+50%乙醇)，購自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養(yǎng)液，購自Gibco公司；Percoll細(xì)胞分離液，購自Sigma-Aldrich公司；抗小鼠Gr-1-PE、CD11b-PerCP、F4/80-APC、CD3-PE、CD8α-APC、CD4-FITC、CD44-PE抗體，購自BD公司；IL-10和IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒，購自R&D公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 IBD誘導(dǎo)及H-E染色 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組采取隨機(jī)分組方法，每組6只，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由數(shù)次實(shí)驗(yàn)總結(jié)歸納得出。實(shí)驗(yàn)組小鼠駱駝奶灌胃0.2 g/(次·只)(奶粉溶于200 μL雙蒸水)，對(duì)照組小鼠雙蒸水灌胃200 μL /(次·只)，灌胃操作持續(xù)14 d。第15天對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠施行禁食12 h后，用5 μL/g水合氯醛注射麻醉，保證小鼠不窒息死亡。用灌腸注射器經(jīng)小鼠肛門給藥，TNBS溶液按100 μL/只緩慢注入小鼠直腸，倒掛小鼠5 min，以免漏液。操作持續(xù)5 d，第7天處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)小鼠結(jié)腸組織切片進(jìn)行 H-E 染色， 在 400 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分并觀察炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.2 腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞的分離提取 處死小鼠并剪開小鼠皮膚和黏膜，暴露小鼠腹腔，用鑷子輕輕取出小鼠結(jié)(直)腸并用生理鹽水洗凈，之后剪碎并轉(zhuǎn)移至離心管，加RPMI 1640培養(yǎng)液至35 mL，37℃ 培養(yǎng)20 min；用紗布過濾后轉(zhuǎn)移至原來的離心管并離心，棄上清液， 用8 mL 45% 密度梯度分離液重懸，之后緩慢加到裝有5 ml 66.6%Percoll離心管并離心；回收上清液并用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋。

1.2.3 FACS檢測(cè) 在提取的小鼠腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞混懸液中分別加入抗Gr-1-PE、CD11b-PerCP、F4/80-APC、CD3-PE、CD8α-APC和CD4-FITC抗體進(jìn)行FACS表面染色檢測(cè)中性粒細(xì)胞(CD11b+Gr1+)、巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+)、CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比。進(jìn)行胞內(nèi)染色時(shí)，向細(xì)胞中加入十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯(phorbol myristate acetate, PMA)(25 ng/mL)、離子霉素(1 μg/mL)以及布雷菲德菌素A(10 μg/mL)，在37 ℃條件下刺激培養(yǎng)5 h后回收細(xì)胞進(jìn)行表面染色，隨后破膜固定細(xì)胞，再加入胞內(nèi)抗體染色，4 ℃孵育30min，離心洗滌，重懸沉淀物。進(jìn)行FACS檢測(cè)，使用FlowJo 7.6軟件分析。

1.2.4 ELISA檢測(cè) 將濃度為2.0×105個(gè)/mL的小鼠腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞接種于包被抗CD3單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)板中，并加入稀釋好的抗CD28單克隆抗體；培養(yǎng)48 h后回收細(xì)胞上清液，加入捕獲抗體，室溫孵育過夜；第2天用封閉液封閉；洗滌并分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，室溫避光孵育2 h；洗滌后加入檢測(cè)抗體，室溫避光孵育；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記物，最后加入底物，室溫避光反應(yīng)20 min；加入終止液終止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)樣品光密度D(450 nm)及D(630 nm)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腸組織及H-E染色實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均下降，但實(shí)驗(yàn)組小鼠下降緩慢，小鼠腸管縮窄減輕，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。取小鼠結(jié)(直)腸組織切片行H-E染色，鏡下觀察均顯示上皮結(jié)構(gòu)不完整，隱窩消失及炎癥細(xì)胞浸潤，但實(shí)驗(yàn)組小鼠在組織學(xué)評(píng)分方面比對(duì)照組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖1)

注：與雙蒸水對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 小鼠腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞亞群百分比和細(xì)胞絕對(duì)數(shù)分析T細(xì)胞亞群時(shí)，在原始FSC-SSC圖中圈門淋巴細(xì)胞，以CD3為橫坐標(biāo)，圈門CD3+細(xì)胞，并以CD4為橫軸、CD8α為縱軸分析CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群百分比。分析中性粒細(xì)胞時(shí)，圈門CD11b+細(xì)胞，并以F4/80為橫軸、Gr-1為縱軸分析中性粒細(xì)胞(CD11b+Gr-1+)和巨噬細(xì)胞亞群(CD11b+F4/80+)百分比。分析Th17亞群時(shí)，圈門淋巴細(xì)胞后，圈出CD4+淋巴細(xì)胞，并以IL-17為橫軸、CD44為縱軸分析Th17亞群百分比。FACS胞外染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腸道黏膜細(xì)胞中CD11b+Gr1+細(xì)胞百分比升高(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分比下降(P<0.05)。FACS胞內(nèi)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道黏膜免疫細(xì)胞中IL-17+CD4+T細(xì)胞即Th17百分比降低(P<0.05)，表明駱駝奶能夠調(diào)節(jié)小鼠腸道黏膜免疫細(xì)胞的百分比，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，抑制CD8+T細(xì)胞增殖(圖2)。駱駝奶對(duì)小鼠TNBS誘導(dǎo)的急性腸炎保護(hù)作用可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

注：與雙蒸水對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3 小鼠腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道黏膜固有層淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平下降，IL-10水平升高(P<0.05)，提示駱駝奶對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥細(xì)胞的作用可能是通過抑制IL-17和促進(jìn)IL-10的分泌完成的(圖3)。

注：與雙蒸水對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

近年來，IBD的發(fā)病呈升高和年輕化趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制涉及飲食、吸煙、遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素。IBD典型發(fā)病癥狀包括腹痛、腹瀉、血便等，嚴(yán)重?fù)p害患者生活質(zhì)量。IBD的發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2細(xì)胞比例失衡和細(xì)胞因子分泌異常密不可分，Th17在腸炎發(fā)展中的作用也至關(guān)重要。Th17可釋放多種細(xì)胞因子如IL-17A、IL-17F、IL-21等，加重組織炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)IBD的發(fā)生與發(fā)展[5]。駱駝奶具有潛在的醫(yī)用價(jià)值，其所含有的類胰島素不易被胃酸破壞，并可增加患者血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。駱駝奶中的不飽和脂肪酸尤其是亞麻酸含量明顯高于牛奶，1型糖尿病患者規(guī)律飲用駱駝奶后，需要胰島素的注射劑量明顯減低[4， 6]。駱駝奶中含有抗腫瘤活性成分，對(duì)乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用[7-8]。IBD發(fā)病機(jī)制的研究基于小鼠、大鼠等動(dòng)物模型，構(gòu)建適宜的動(dòng)物模型對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制及病程進(jìn)展十分重要。目前，建立IBD動(dòng)物模型應(yīng)用最廣泛的方法是通過外源化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)，包括惡唑酮、TNBS及葡聚糖硫酸鈉[9-10]。本研究以TNBS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠腸炎模型為研究對(duì)象，模擬人腸道環(huán)境，探究駱駝奶對(duì)腸道黏膜免疫細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的影響，進(jìn)一步探究駱駝奶對(duì)TNBS誘導(dǎo)小鼠腸炎的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，與雙蒸水對(duì)照組相比，駱駝奶實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降緩慢，組織學(xué)評(píng)分低，表明駱駝奶對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎有保護(hù)作用。FACS結(jié)果顯示駱駝奶能有效抑制腸炎模型中小鼠CD8+T細(xì)胞亞群百分比，抑制IL-17的分泌。CD8+T細(xì)胞是CTL亞群，具有殺傷功能，有促進(jìn)腸炎進(jìn)展的作用。IBD患者的結(jié)腸組織中Th17比例升高，而Th17分泌IL-17參與結(jié)腸黏膜病理損傷，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、前列腺素E2等炎性因子，募集中性粒細(xì)胞。在炎癥后期，IL-17促進(jìn)Th分化和趨化因子生成，加重組織損傷[11-12]。駱駝奶灌胃后，CD8+T細(xì)胞亞群百分比下降，IL-17濃度降低，說明駱駝奶對(duì)小鼠急性腸炎具有保護(hù)作用。目前已知并非只有特定的T細(xì)胞亞群才能合成IL-10，幾乎所有淋巴細(xì)胞均能合成IL-10。CD11b+Gr1+中性粒細(xì)胞也能合成IL-10，駱駝奶灌胃后中性粒細(xì)胞百分比增加，而ELISA結(jié)果顯示小鼠腸黏膜固有層細(xì)胞分泌IL-17水平降低，而IL-10升高。IL-10作為潛在的抑炎因子，在人胃腸道穩(wěn)態(tài)維持過程中起重要作用。有研究表明， 小鼠體內(nèi)IL-10缺乏會(huì)誘發(fā)自發(fā)性IBD，其發(fā)病機(jī)制與Th介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)[13]。駱駝奶灌胃后，小鼠體內(nèi)IL-10水平增高而IL-17下降說明駱駝奶能夠調(diào)節(jié)小鼠腸道細(xì)胞因子分泌，這為駱駝奶輔助臨床治療IBD提供新的可能性。

綜上所述，駱駝奶對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠急性腸炎具有保護(hù)作用，該作用可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。駱駝奶可以抑制CD8+T細(xì)胞增殖，減少IL-17的分泌，同時(shí)促進(jìn)IL-10的分泌。進(jìn)一步探究駱駝奶在IBD中的保護(hù)作用是接下來的研究方向。