外周血T細(xì)胞及雙陰性T細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者中的變化及臨床意義

孫克娜，陳英劍，宋御繁，劉曉斐

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，濰坊 261053；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院 檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250031)

2018年全球癌癥調(diào)查研究報(bào)告顯示，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率居第3位，病死率居第2位，發(fā)展中國(guó)家CRC發(fā)病率比發(fā)達(dá)國(guó)家高3倍[1]。我國(guó)是CRC發(fā)病的高危國(guó)家，但目前CRC的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，也無(wú)特異的早期診斷和治療方法[2]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)具有重要的抗腫瘤作用，機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用以T細(xì)胞及其亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主[3]。然而，機(jī)體抗腫瘤作用的實(shí)現(xiàn)依賴于T細(xì)胞功能的正常發(fā)揮，免疫抑制可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。雙陰性T細(xì)胞(double-negative T cell，DNT)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種Treg，其表面既不表達(dá)CD4抗原也不表達(dá)CD8抗原。DNT占正常人外周血總淋巴細(xì)胞的1%～5%[5]，在CRC患者中的表達(dá)規(guī)律尚無(wú)統(tǒng)一的結(jié)論。目前，DNT抗腫瘤作用成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬以健康人為對(duì)照，通過(guò)FACS檢測(cè)術(shù)前、術(shù)后及不同臨床分期CRC患者的T細(xì)胞亞群及DNT分布情況，分析CRC患者及其術(shù)后細(xì)胞免疫功能狀況，探討相關(guān)的作用及免疫機(jī)制，旨在為臨床CRC的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年6月—2019年11月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院確診的93例CRC患者為CRC組，其中男性50例、女性43例，年齡(61.2±11.2)歲。患者中，結(jié)腸腫瘤40例、直腸腫瘤53例；病理類型：腺癌73例、黏液腺癌+印戒細(xì)胞癌20例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期61例、Ⅲ+Ⅳ期32例。另選取54例同期健康體檢者作為健康組，其中男性29例、女性25例，年齡(60.7±13.4)歲。2組研究對(duì)象性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。樣本按統(tǒng)一流程進(jìn)行篩選(圖1)。同時(shí)，將93例CRC患者按臨床分期分為2組，即Ⅰ+Ⅱ期組、Ⅲ+Ⅳ期組，2組基線資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 樣本篩選流程

1.2 試劑與儀器CD45-FITC/CD4-藻紅蛋白(phycoeryth，PE)/CD8-藻紅蛋白-德克薩斯紅(phycoerythrin Texas red，ECD)/CD3-藻紅蛋白藕聯(lián)物(phycoerythrin coupling compound 5，PC5)和FC500流式細(xì)胞儀均購(gòu)自貝克曼-庫(kù)爾特公司。

1.3 方法采集健康者和CRC患者術(shù)前及術(shù)后第7天的空腹靜脈血2 mL，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，在樣本采集完成后6 h內(nèi)檢測(cè)。按照檢測(cè)要求，向流式試管內(nèi)分別加入10 μL單克隆抗體，隨即加入100 μL抗凝血，振蕩混勻，室溫下避光孵育20 min，加入溶血?jiǎng)┤芙饧t細(xì)胞后，按照操作程序上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)以CD45 /SSC 和 CD3 /SSC 圈定淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞，每次檢測(cè)前均用Flow Check對(duì)儀器流路、光路進(jìn)行校準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者外周血T細(xì)胞亞群及DNT比例的FACS分析采用FACS分析CRC患者和健康者外周血T細(xì)胞亞群及DNT比例。結(jié)果顯示，與健康組比較，CRC組CD3+T細(xì)胞和CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，DNT比例顯著升高(P<0.05)，CD3+CD8+T細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有升高的趨勢(shì)。(圖2、表1)

注：A～D.分別為CRC組CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和DNT FACS散點(diǎn)圖；E～H.分別為健康組CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和DNT FACS散點(diǎn)圖。

表1 CRC組和健康組外周血T細(xì)胞亞群及DNT的分布

2.2 CRC患者手術(shù)前后外周血T細(xì)胞亞群及DNT的FACS分析為初步明確手術(shù)治療后CRC患者外周血T細(xì)胞亞群及DNT比例的變化，采用FACS進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與術(shù)前比較，CRC患者術(shù)后CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，DNT比例顯著降低 (P<0.05)。(圖3、表2)

表2 CRC患者手術(shù)前后T細(xì)胞亞群及DNT的分布

注：A～D.分別為CRC患者手術(shù)前CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和DNT FACS散點(diǎn)圖；E～H.分別為CRC患者手術(shù)后CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和DNT FACS散點(diǎn)圖。

2.3 不同臨床分期CRC患者外周血T細(xì)胞亞群及DNT的FACS分析為比較Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期CRC患者外周血T細(xì)胞亞群及DNT的分布差異，采用FACS進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與Ⅰ+Ⅱ期CRC組比較，Ⅲ+Ⅳ期CRC組DNT比例顯著降低(P<0.05)(表3)。Ⅲ+Ⅳ期患者DNT雖顯著降低，但與健康組比較表達(dá)水平仍升高(Z=5.72，P<0.05)。

表3 Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期CRC患者T細(xì)胞亞群及DNT的分布

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫狀態(tài)密切相關(guān)，惡性腫瘤患者免疫功能低下，腫瘤細(xì)胞容易增殖[5]。T細(xì)胞亞群的數(shù)量和比例是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[6]。T細(xì)胞亞群的比例失衡和功能異常，可導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并誘發(fā)一系列病理變化，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，基于分化抗原分子的不同，CD3+T總淋巴細(xì)胞大體可劃分為CD4+和CD8+T細(xì)胞2個(gè)亞群[8]。CD4+T細(xì)胞為輔助性 T細(xì)胞，在細(xì)胞因子和抗原等的刺激下，進(jìn)一步分化為T(mén)h2、Th17、濾泡輔助性T細(xì)胞、Treg、Th9和Th22，輔助機(jī)體完成抗腫瘤免疫[9]。CD8+T細(xì)胞可分為抑制性T細(xì)胞和CTL：一方面，CD8+T細(xì)胞通過(guò)自身抑制因子在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，使CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞功能受到抑制，從而抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)；另一方面，CD8+T細(xì)胞可通過(guò)顆粒酶/穿孔素等多種途徑對(duì)突變細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，腸癌患者外周血CD3+和CD4+T細(xì)胞的比例明顯下調(diào)，CD8+T細(xì)胞比例上調(diào)[11]，這與本研究結(jié)果相似，說(shuō)明CRC患者處于免疫抑制狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者術(shù)后CD3+CD4+T細(xì)胞比例較術(shù)前明顯升高，提示CD4+T細(xì)胞輔助參與的體液免疫相對(duì)增強(qiáng)。目前，隨著T細(xì)胞亞群研究機(jī)制的不斷深入，腫瘤免疫指標(biāo)的檢測(cè)和免疫治療方案的制定越來(lái)越受到臨床關(guān)注。腸鏡病理檢查對(duì)患者和醫(yī)師要求較高，可能會(huì)出現(xiàn)穿孔、出血等不良反應(yīng)，無(wú)法成為大規(guī)模使用的初篩工具。通過(guò)監(jiān)測(cè)CRC患者T細(xì)胞亞群的表達(dá)，可進(jìn)一步評(píng)估患者的抗腫瘤免疫功能，進(jìn)而為判斷患者預(yù)后及設(shè)計(jì)更為切實(shí)可行的治療方案提供理論依據(jù)，該方法簡(jiǎn)便易行，有望今后在基層醫(yī)院得到深入開(kāi)展。

研究發(fā)現(xiàn)，在B16F10小鼠黑色素瘤模型中，DNT可抑制CD4+T細(xì)胞的殺傷功能，減少腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，且小鼠體內(nèi)DNT數(shù)量與腫瘤大小呈正相關(guān)[12-13]，說(shuō)明DNT有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。另外，在研究DNT的腫瘤免疫治療中發(fā)現(xiàn)，DNT對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用：(1)通過(guò)Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]；(2)通過(guò)顆粒酶/穿孔素途經(jīng)殺傷腫瘤細(xì)胞[15]；(3)通過(guò)分泌細(xì)胞因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-17和顆粒酶B)作用于腫瘤細(xì)胞[16]。(4)通過(guò)NK細(xì)胞活化性受體及其配體MHCⅠ類相關(guān)基因A途徑直接殺傷腫瘤細(xì)胞[17-18]；(5)通過(guò)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體及其受體途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組患者DNT比例顯著高于健康組，并且Ⅲ+Ⅳ期CRC患者 DNT比例較Ⅰ+Ⅱ期患者明顯降低。這些結(jié)果提示，DNT在CRC中可能發(fā)揮正向的殺傷腫瘤作用。患者手術(shù)后DNT比例顯著降低，表明在CRC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能存在DNT的調(diào)節(jié)紊亂或異常表達(dá)。

DNT作為一種獨(dú)特的調(diào)節(jié)性細(xì)胞群，具有免疫抑制功能，可以選擇性地抑制CD4+T細(xì)胞的mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制CD4+T細(xì)胞的增殖和功能，其被稱作“天生的抑制器”[20]。研究發(fā)現(xiàn)，OX40在CRC腸系膜淋巴結(jié)等部位高表達(dá)，并且能夠調(diào)控CD4+T細(xì)胞向DNT轉(zhuǎn)化，提高DNT的轉(zhuǎn)化效率，并且抑制DNT凋亡[21-22]。這可能是CRC患者DNT升高而CD4+T細(xì)胞下降的原因。DNT的具體作用機(jī)制尚不完全明確，DNT是否還通過(guò)其他的途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，尚需進(jìn)一步研究。同時(shí)，臨床分期是決定CRC治療效果和預(yù)后的重要依據(jù)，但傳統(tǒng)診斷技術(shù)在CRC臨床分期過(guò)程中可能存在主觀因素的影響。如果能通過(guò)分子免疫學(xué)方法加以輔助分期，可能對(duì)CRC治療和預(yù)后的準(zhǔn)確判斷更有意義。

綜上所述，本研究證實(shí)了CRC患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂及DNT高表達(dá)，而在晚期患者中出現(xiàn)DNT表達(dá)降低，這些結(jié)果為DNT在腫瘤免疫中的作用研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。CRC患者外周血T細(xì)胞及DNT檢測(cè)有望成為評(píng)估術(shù)前機(jī)體免疫狀態(tài)、手術(shù)預(yù)后及治療效果的指標(biāo)，為CRC的診斷、臨床分期及制定免疫治療策略提供新的思路和理論依據(jù)。