Spata2-CYLD去ASC線性泛素化抑制NLRP3炎癥小體活化

吳丹丹，蔣小麗，張雙艷，李文果，楊曉東

(上海交通大學醫(yī)學院 上海市免疫學研究所，上海 200025)

炎癥小體是近年來發(fā)現(xiàn)的一類由PRR參與組裝的多蛋白復合物。作為固有免疫的重要傳感器，它能夠識別PAMP和宿主來源的(內(nèi)源性)危險信號，招募并活化蛋白酶Caspase-1，誘導細胞焦亡和促炎細胞因子IL-1β以及IL-18的成熟與分泌，促進炎癥發(fā)生[1-3]。目前已有多種可以感知不同上游信號的炎癥小體被發(fā)現(xiàn)，包括NLRP1、含NACHT-LRR-PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)、NLRC4和AIM2等[4]。NLRP3炎癥小體由受體NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和效應蛋白Caspase-1組成，可以被結(jié)構(gòu)和功能迥異的多種外來危險物質(zhì)如尼日利亞菌素、明礬，以及各種機體異常代謝產(chǎn)物如尿酸結(jié)晶、膽固醇結(jié)晶和β-淀粉樣蛋白等激活[1]。NLRP3炎癥小體異?；罨瘯е乱幌盗凶陨硌装Y性疾病，還與糖尿病、阿爾茨海默病、類風濕關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)[5]。因此，全面理解NLRP3炎癥小體活化的調(diào)控機制至關(guān)重要。

蛋白翻譯后修飾，尤其是泛素化，是炎癥小體活化的重要調(diào)控機制之一[6]。圓柱瘤蛋白(cylindromatosis tumor suppressor protein, CYLD)是一個具有線性連接和K63連接特異性的去泛素化酶[7-8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，精子發(fā)生相關(guān)蛋白2(spermatogenesis-associated protein 2, Spata2)與CYLD形成的復合物通過去泛素化NLRP3炎癥小體上游調(diào)節(jié)蛋白Polo樣蛋白激酶4(Polo-like kinases 4, PLK4)的K63位點抑制炎癥小體活化[9]。有研究表明，線性泛素連接酶線性泛素鏈組裝復合物(linear ubiquitin chain assembly complex, LUBAC)能夠直接修飾接頭蛋白ASC促進NLRP3炎癥小體活化[10]。但是逆轉(zhuǎn)這一過程的去泛素化酶尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，Spata2-CYLD去泛素化酶能夠結(jié)合至NLRP3炎癥小體并特異性去除LUBAC介導的ASC線性泛素化，從而抑制炎癥小體活化，闡示了Spata2-CYLD去泛素化酶復合物負調(diào)控炎癥小體活化的新機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞人胚胎腎細胞293(human embryonic kidney cell 293, HEK293)，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。使用含10% FBS和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)該細胞。

1.2 實驗試劑DMEM培養(yǎng)液，購自康寧公司；FBS和青/鏈霉素，購自Gibco公司；尼日利亞菌素，購自InvivoGen公司；Hoechst染料，購自Invitrogen公司；Flag-M2微珠和小鼠抗Flag抗體，購自Sigma-Aldrich公司；小鼠抗人Spata2-HRP、IgG-HRP和泛素蛋白(ubiquitin)抗體，購自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司；大鼠抗HA-HRP抗體，購自上海羅氏制藥有限公司；兔抗GFP抗體，購自CST公司；小鼠抗人NLRP3和Caspase-1抗體，購自AdipoGen公司；兔抗人線性泛素鏈抗體，購自默克密理博公司。 HOIP和HOIL表達質(zhì)粒，購自Addgene公司；ASC點突變構(gòu)建采用的定點突變試劑盒，購自Stratagene公司。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建帶標簽的Spata2、CYLD、NLRP3、ASC、Caspase-1和NIMA相關(guān)蛋白激酶7(NIMA-related kinase 7, NEK7)表達質(zhì)粒信息見本課題組已發(fā)表文章[9]；NLRP3的缺失突變表達質(zhì)粒，見文獻[11]報道。

1.4 免疫沉淀(immunoprecipitation， IP)實驗用NP-40裂解液[含50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)、250 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1% NP-40]于4 ℃冷庫裂解細胞20 min；將裂解物與結(jié)合抗體的瓊脂糖微珠于4 ℃孵育2 h；用裂解液漂洗微珠3次，2×SDS樣本緩沖液重懸；于95 ℃變性處理10 min，用于SDS-PAGE和Western blotting檢測。

1.5 去泛素化分析變性IP法：用含1% SDS的NP-40裂解液裂解細胞，并用超聲波振蕩處理細胞裂解液，15 000×g離心后收集上清液，用不含SDS的NP-40裂解液稀釋10倍后，與抗體結(jié)合的瓊脂糖微珠共孵育3 h，裂解液漂洗3次；2×SDS樣本緩沖液重懸微珠，于95 ℃變性處理10 min，用于SDS-PAGE和Western blotting檢測。親和純化方法：將谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)和人源NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB-essential modulator, NEMO)的特異結(jié)合線性泛素鏈的Cozi結(jié)構(gòu)域(AA 257～346)[12]與GST的融合蛋白分別于大腸埃希菌菌體內(nèi)表達并純化至谷胱甘肽微珠上，然后加至NP-40裂解液制備的蛋白提取液中，于4 ℃孵育2 h;裂解液漂洗3次，加入樣本緩沖液如上所述進行變性和Western blotting檢測。

1.6 激光共聚焦顯微鏡成像在HEK293細胞中共轉(zhuǎn)染帶mCherry熒光標簽的Spata2、GFP熒光標簽的ASC、Flag標簽的NLRP3和NEK7，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，24 h后加入DNA染料Hoechst進行活細胞染色，用激光共聚焦顯微鏡(LEICA SP8)進行熒光成像分析。

2 結(jié)果

2.1 Spata2對ASC線性泛素化的影響B(tài)eutler研究組首次建立并證實了在HEK293細胞重建NLRP3炎癥小體并分析其活化調(diào)控機制的方法體系[13]，本課題組在最近的研究中也運用該方法分析NLRP3被泛素化調(diào)控的分子機制[9]。本研究繼續(xù)采用該方法探究Spata2-CYLD對ASC線性泛素化的調(diào)控作用。首先，將ASC-GFP與炎癥小體其他組分以及Spata2共表達到HEK293細胞中，在變性條件下IP純化ASC-GFP，Western blotting分析其線性泛素化。用尼日利亞菌素刺激后，與炎癥小體其他組分共表達的ASC發(fā)生了明顯的線性泛素化(泳道2)，但是在Spata2共表達的情況下，ASC線性泛素化水平明顯下降(泳道3)，表明Spata2能夠抑制炎癥小體激活時ASC的線性泛素化(圖1)。

注：于HEK293細胞中共表達ASC-GFP、Spata2以及炎癥小體其他組分，變性條件下IP純化ASC-GFP，Western blotting分析ASC線性泛素化水平。

2.2 Spata2-CYLD去泛素化酶復合物對LUBAC介導的ASC線性泛素化的影響與文獻報道相一致，ASC-GFP與線性泛素化連接酶LUBAC (HOIP和HOIL) 共表達時，可檢測到依賴LUBAC的ASC線性泛素化(泳道2)；同時共表達CYLD時，ASC線性泛素化水平降低(泳道4)；同時共表達Spata2和CYLD時，ASC線性泛素化水平進一步降低(泳道5)(圖2)。這提示LUBAC介導的ASC線性泛素化可被Spata2-CYLD去泛素化酶復合物去除。

注：于HEK293細胞中共表達ASC-GFP、LUBAC (HOIP和HOIL) 以及CYLD和Spata2，變性條件下IP純化ASC-GFP，Western blotting分析ASC線性泛素化情況。

2.3 ASC的K21/K22/K24/K26位點對其線性泛素化和NLRP3炎癥小體活化的影響為找到ASC線性泛素化發(fā)生位點，研究進行了位點突變分析：將賴氨酸突變成不能發(fā)生泛素化但理化性質(zhì)相似的精氨酸，然后與LUBAC共表達。結(jié)果顯示，賴氨酸K21/K22或者K24/K26位點突變成不能被泛素化的精氨酸R時， ASC幾乎不能發(fā)生線性泛素化，而所有其他賴氨酸位點的突變并不影響ASC線性泛素化(圖3A)。在分析該條件下NLRP3介導的Caspase-1激活情況時，研究發(fā)現(xiàn)與線性泛素化相一致，K21/K22和K24/K26位點突變不同程度地抑制了Caspase-1的激活(圖3B)。以上結(jié)果表明，K21/K22/K24/K26位點對ASC線性泛素化和ASC激活炎癥小體而言都是必要的，同時提示Spata2-CYLD去泛素化酶復合物和LUBAC連接酶復合物協(xié)同調(diào)控ASC這幾個賴氨酸位點的線性泛素化/去泛素化進而調(diào)控NLRP3炎癥小體的活化。

注：A．于HEK293細胞中共表達ASC-GFP及其突變體、LUBAC，GST或GST-Cozi富集線性泛素化蛋白，Western blotting分析ASC的線性泛素化程度；B. 于HEK293細胞中共表達ASC-GFP及其突變體和炎癥小體其他組分，分析NLRP3介導的Caspase-1的激活情況。

2.4 ASC與Spata2的共定位情況最近的研究發(fā)現(xiàn)，Spata2主要定位于細胞的中心體，并能招募CYLD到中心體發(fā)揮調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的功能[9]。為探究Spata2-CYLD如何促進ASC去泛素化，研究進行了激光共聚焦定位分析。與之前的報道一致，帶mCherry熒光標簽的Spata2主要富集于中心體，呈點狀結(jié)構(gòu)；共表達的ASC-GFP也呈點狀信號，而且能與Spata2的點狀信號較好重疊(圖4)。這提示ASC與Spata2在細胞中共定位，這一發(fā)現(xiàn)為理解Spata2-CYLD 去泛素化ASC提供了細胞學基礎(chǔ)。

注：于HEK293細胞中共表達帶紅色熒光蛋白標簽的Spata2、帶綠色熒光蛋白標簽的ASC、帶Flag標簽的NLRP3和NEK7，24 h后加入DNA染料Hoechst(藍色)進行活細胞染色，用激光共聚焦顯微鏡進行熒光成像分析。

2.5 Spata2與NLRP3炎癥小體的相互作用為進一步闡明Spata2-CYLD調(diào)控 ASC去泛素化的分子機制，研究采用IP分析了Spata2與NLRP3炎癥小體主要組分的相互作用。在共表達細胞中，Spata2特異地與NLRP3蛋白結(jié)合，而不與ASC或Caspase-1結(jié)合(圖5A)。進一步對NLRP3的缺失突變體分析發(fā)現(xiàn)，Spata2主要通過NLRP3的C末端(氨基酸91～710和711～1 034)而不是N末端(氨基酸1～90)與其結(jié)合(圖5B)。以上結(jié)果提示，Spata2-CYLD可能通過NLRP3蛋白結(jié)合至炎癥小體復合物發(fā)揮調(diào)控ASC去泛素化的功能。

注：A. 于HEK293細胞中共表達Spata2和炎癥小體主要成分，通過Flag-M2微珠IP Flag-NLRP3、Flag-ASC、Flag-Caspase-1，Western blotting(WB)檢測與之結(jié)合的V5-Spata2；B. 于HEK293細胞中共表達Spata2和NLRP3的缺失突變體， 通過Flag-M2微珠IP Flag-NLRP3，Western blotting檢測與之結(jié)合的V5-Spata2。FL:full-length protein, 全長蛋白。1～90、91～710、711～1 034分別為NLRP3蛋白的3個不同截斷片段(數(shù)字為氨基酸位置)。

3 討論

蛋白質(zhì)泛素化是一種重要的可逆性翻譯后修飾，調(diào)節(jié)包括炎癥和免疫反應在內(nèi)的許多生物學過程。蛋白質(zhì)泛素化是在E1、E2和E3 3種酶的催化下把泛素分子共價連接到底物蛋白特定賴氨酸上的酶學過程[14]，這一反應過程在同一賴氨酸上的多次重復發(fā)生會形成由多個泛素分子組成的泛素鏈。泛素鏈在去泛素化酶的催化作用下可被去除。依據(jù)連接位點的不同，泛素鏈可分為K6、K11、K29、K33、K48和K63連接型，以及近年來發(fā)現(xiàn)的M1連接形式(又叫線性泛素化)[7]。不同類型的泛素化具有不同的生物學功能，例如K48連接的泛素鏈會引發(fā)依賴蛋白酶體的降解；而非降解性的M1連接的泛素鏈則調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的激活和固有免疫反應[15]。

目前已知的唯一一個線性泛素化酶E3是由HOIP和HOIL或者SHARPIN組成的名為LUBAC的酶復合物，其中HOIP具有E3活性，是催化亞基，HOIL或者SHARPIN則是必須的調(diào)節(jié)亞基[16-17]。對于LUBAC和線性泛素化的功能研究最多的是它們對炎癥反應和細胞死亡的調(diào)控作用[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，LUBAC還能調(diào)控炎癥小體活化[10，19]，它能夠特異性線性泛素化接頭蛋白ASC，極大促進了NLRP3炎癥小體的激活[10]。但是針對線性泛素化ASC的去泛素化酶至今未知。與眾多調(diào)控炎癥小體的E3泛素連接酶相比，有關(guān)調(diào)控炎癥小體的去泛素化酶報道較少。Py等[20]課題組證實BRCC3可去泛素化NLRP3蛋白復合體，而Duong等[21]闡明A20通過逆轉(zhuǎn)IL-1前體的泛素化抑制炎癥小體激活。課題組最近的研究揭示接頭蛋白Spata2與CYLD調(diào)控細胞死亡和炎癥反應[22]，進一步發(fā)現(xiàn)Spata2與CYLD形成去泛素化酶復合物定位于細胞中心體，通過去除NLRP3炎癥小體上游調(diào)節(jié)蛋白PLK4的K63泛素化抑制炎癥小體活化[9]。PLK4的K63泛素化能夠阻止它與NEK7的結(jié)合從而促進NEK7對炎癥小體的激活，Spata2與CYLD介導的K63去泛素化則促進PLK4-NEK7結(jié)合以及PLK4對NEK7的磷酸化，磷酸化的NEK7失去與NLRP3蛋白的結(jié)合能力和對炎癥小體的激活作用[9]。這些發(fā)現(xiàn)建立了一條定位于中心體的信號通路，通過調(diào)控NLRP3上游調(diào)節(jié)蛋白的泛素化水平調(diào)節(jié)炎癥小體的活化。

本研究結(jié)果表明，Spata2-CYLD去泛素化酶復合物能夠通過與NLRP3蛋白相互作用結(jié)合至炎癥小體復合物，去除LUBAC依賴的ASC線性泛素化，抑制ASC介導的NLRP3炎癥小體活化(圖6)。這一方面揭示了Spata2-CYLD可調(diào)控NLRP3炎癥小體核心組成蛋白的泛素化，提供了Spata2-CYLD調(diào)節(jié)炎癥小體活化的又一新機制；另一方面首次報道了逆轉(zhuǎn)ASC線性泛素化的去泛素化酶，為NLRP3炎癥小體活化調(diào)控提供了新認識，為炎癥小體相關(guān)炎癥性疾病的治療提供了新的潛在策略。

圖6 Spata2-CYLD去泛素化酶復合物去除ASC線性泛素化抑制NLRP3炎癥小體活化