組織蛋白酶在類風濕關節炎中的作用

王 鑫,劉大軍,郭盈盈,張佳琳,張曉莉*

0 引言

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現的一種慢性、全身性自身免疫性疾病,RA的主要病理機制是軟骨基質的降解,在RA中,參與關節降解的主要細胞類型有滑膜纖維母細胞樣細胞(Synovial fibroblast-like cells)、軟骨細胞(Chondrocytes)和破骨細胞(Osteoclasts)[1],這些細胞通過分泌蛋白水解酶和/或吞噬細胞外基質成分來破壞軟骨和軟骨下骨[2]。許多證據表明,膠原蛋白水解酶和組織蛋白酶(Cathepsin,Cat)是降解軟骨和骨中主要蛋白成分的關鍵蛋白酶,Cat缺乏小鼠關節炎的嚴重程度較低[3],Cat S敲除小鼠關節炎的易感性較低[4],Cat K可能參與了軟骨細胞外基質的降解,其抑制劑可能是未來治療慢性關節炎的一種重要選擇。本文將對Cat S和Cat K的生物學特征及其在RA中的作用進行綜述。

1 RA的病理改變

RA的基本病理表現是滑膜炎,其特征是大量淋巴細胞的流入。淋巴細胞浸潤和通過滑膜的遷移需要局部基質的降解。RA患者的臨床表現主要是異常的免疫和炎癥反應,但發病機制尚未闡明。但已知的是RA的發病機制并不是由單一的一種細胞構成,而是由多種類型細胞共同參與,主要包括肥大細胞、成纖維細胞、巨噬細胞,其次還有T細胞[5]、B細胞[6]、樹突狀細胞[7]、軟骨細胞和破骨細胞等。正常滑膜中肥大細胞約占滑膜表面細胞的3%;而在RA患者滑膜中其數量增長了5～24倍,這些細胞于血管翳、軟骨交界處及血管翳侵入骨皮質處過度表達[8],說明肥大細胞在RA疾病中起著重要作用。而肥大細胞及巨噬細胞是Cat S的兩個主要來源,其也可以由小膠質細胞、B淋巴細胞和樹突狀細胞等免疫細胞產生。Cat K高表達于纖維母細胞樣滑膜細胞和巨噬細胞樣滑膜細胞、軟骨破骨細胞和多核巨細胞,雖然早期的研究表明Cat K只在破骨細胞中表達,但最近的研究揭示了更廣泛的分布模式。除了在破骨細胞、相關的軟骨細胞和多核巨細胞中表達外,單核細胞作為破骨細胞的前體細胞,Cat K在單核細胞中也有表達[9]。

2 組織蛋白酶的生物學特性

Cat是一類溶酶體蛋白酶,在機體內參與蛋白降解、抗原提呈、細胞凋亡等生理過程,且與腫瘤、哮喘、類風濕關節炎、牙周炎等疾病的發病機制有關。人Cat K和Cat S屬于Cat家族,Cat家族在人類細胞中有11個成員[10],這些酶具有緊密的三維結構,因而具有相同的催化機制和重疊底物特異性[11]。它們主要參與酸性溶酶體和/或內核室小體內的內吞蛋白的終末降解[12-13]。

2.1 組織蛋白酶S的生物學特性 Cat S是一種屬于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶[12],由炎癥誘導[13]。1992年,人類Cat S首次從肺泡巨噬細胞中被提取出來。其分布具有組織特異性,主要存在于網狀內皮系統中,也多在表達主要組織相容性復合體Ⅱ(Major histocompatibility complex Ⅱ,MHCⅡ)的細胞中表達。Cat S能分解抗原和抗菌肽[14]，在抗原處理和表達過程中很重要。在細胞外,Cat S在中性環境下保持穩定和活性,對多種蛋白具有催化水解活性,主要負責處理外圍樹突狀細胞中的不變鏈[15],特別是MHC II的恒定鏈和細胞外基質成分[16],其次，Cat S作為一種彈性酶，能夠破壞細胞外基質蛋白,如膠原蛋白和細菌外膜蛋白[17]。因此,Cat S在MHC II處理以及T細胞刺激中發揮重要作用。

2.2 組織蛋白酶K的生物學特性 Cat K類似于木瓜蛋白酶,是一種重要的骨吸收蛋白酶,在骨吸收破骨細胞中構成主要的蛋白水解活性[13],被認為是破骨細胞介導骨吸收的關鍵蛋白酶。Cat K在滑膜層及滑膜下區域的表達最為明顯,參與了軟骨的降解。Cat K缺乏會導致結節病,一種硬化性骨發育不良,這一發現支持了上述結論[12]。Cat K可能有助于抗原的處理和/或表達,并通過軟骨中的糖胺聚糖選擇性調節酶的膠原降解活性[18]。

3 組織蛋白酶在RA發病中的作用

Cat K和Cat S在細胞外基質降解和炎癥反應的各個方面都有作用。Cat S參與了MHC II類抗原的表達。它可能還具有蛋白聚糖降解活性,在中性和酸性環境中發揮強大的水解軟骨聚集蛋白聚糖的作用[19]。成纖維細胞樣滑膜細胞分泌成熟Cat K,提示Cat K可能參與軟骨細胞外基質降解,Cat K表達的增加主要與類滑液成纖維細胞群在RA標本的滑液下和血管周圍區域的擴張有關,提示該蛋白酶可能在該疾病的發病機制中發揮作用。相比之下,Cat S主要存在于巨噬細胞樣滑膜細胞中,在抗原呈遞和基質降解方面具有雙重功能[6]。

3.1 組織蛋白酶的作用機制 Cat分解不變鏈(li)衍生的前肽Lip10(p10),最終將片段(ii類相關不變鏈肽)留在主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex,MHC)上。由于只有剪切加載的MHC II分子才能在吞噬溶酶體內加載外源性肽序列,所以，Cat的分裂活性對CD4 T細胞的抗原呈遞至關重要。這表明,Cat S可能是破壞軟骨細胞分泌的MHC II的主要因素,因此,推測提高Cat的活性可能會導致MHC II表達和自身免疫水平升高,而抑制Cat可能是一種抑制MHC II介導的T細胞自身免疫反應的新方法。由于抗原提呈細胞(Antigen-presenting cell,APC)中p10的分裂只發生在Cat身上,因此，細胞內p10的積累是一個有效的Cat抑制的生物標志物[20]。

3.2 組織蛋白酶S與RA疾病活動呈正相關 如上所述,Cat S和Cat K參與了細胞外基質降解和炎癥反應的各個方面,近年的研究發現,Cat S可能通過其蛋白水解活性、調控滑膜炎癥及骨破壞參與了RA的發病。趙進軍等[21]在相關研究中使用兩個品系的小鼠,在C57BL/6小鼠中發現了血清中Cat S的水平在膠原抗體誘導關節炎(Collagenantibody induced arthritis,CAIA)組明顯升高,且踝關節滑膜中Cat S的表達明顯升高,尤其在肥大細胞激活劑C48/80組更加顯著,而使用肥大細胞的膜穩定劑DSCG可使Cat S的表達下降。因此認為在肥大細胞敲除的KitW-sh/W-sh小鼠中使用抗Ⅱ型膠原抗體不能誘導CAIA模型,而加用外源骨髓源性肥大細胞(Bone marrow derivedmast cells,BMMCs)后可成功誘導模型。

Cat S高表達于RA患者的滑膜中,包括CD68+巨噬細胞樣滑膜細胞、交叉細胞和血管內皮細胞,臨床發現,Cat S與RA的臨床活動密切相關,血清中Cat S的表達遠高于對照組(健康體檢者),而且其表達水平與RA疾病活動度(DAS-28)正相關,并與RF水平相關,但與抗CCP抗體的基線水平無關。前期臨床研究發現,在體外共培養小鼠BMMCs和關節軟骨細胞時,用C48/80激活的BMMCs可破壞軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原,而加入Cat S的特異性抑制劑LHVS和非特異性抑制劑E64后,軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原量恢復[22],這說明Cat S對軟骨細胞尤其是膠原表達有一定的負向調控作用。

Cat L、Cat S和MMP-3在RA患者關節腔積液(SF)中的水平明顯高于血清。ACPA、IgM-RF和IgA-RF患者的血清Cat水平均顯著高于無這些抗體的患者。ACPA和RF陽性患者中,兩種組織蛋白酶的血清水平與DAS28和CRP相關,而在血清陰性患者中不相關;ACPA陽性和ACPA陰性、IgA和IgM陽性和陰性患者的Cat S和Cat L的循環水平存在顯著差異[23]。有自身抗體和沒有自身抗體的RA患者Cat S和Cat L的差異表明,這些Cat在血清陽性RA的疾病過程中有特定的作用。在該表型中,Cat血清水平可能反映自身免疫活性,而血清水平可能反映關節局部炎癥和基質降解過程。其他文獻報道了ACPA陽性RA患者血清Cat K水平升高,這支持了ACPA抗體誘導破骨細胞形成的假說,并且是自身免疫和關節破壞之間的直接聯系[23]。由此可見,自身抗體與破骨細胞介導的RA患者骨吸收的Cat之間有很強的特異性關聯[21]。在一定程度上提示,Cat S可能參與RA的疾病過程。

3.3 組織蛋白酶S/K調控RA滑膜炎癥和骨破壞 RA軟骨侵蝕是由激活的軟骨細胞、覆蓋在滑膜上的軟骨和透明軟骨的軟骨下細胞浸潤所引起的三向過程。軟骨下骨主要由骨/軟骨細胞、多核巨細胞和單核前體細胞降解。研究發現,核因子κB配體(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)藥物對滑膜成纖維細胞的靶向可能足以抑制RA中破骨細胞的活性和防止骨破壞[22]。Cat S存在于RA患者關節的滑膜巨噬細胞中,分泌蛋白酶進入軟骨基質引起炎性反應,軟骨聚集蛋白聚糖-C II網狀組織的完整性可能被破壞[24],從而參與RA的滑膜炎癥。Cat K高表達于侵襲滑膜巨噬細胞和滑膜成纖維細胞,提示該蛋白酶參與了RA的軟骨侵蝕[19]。Cat K缺乏會導致骨硬化性疾病(致密性成骨不全癥),在分子水平上,其特征是在骨重建過程中I型膠原降解不足,這證明Cat K在骨破壞及骨重建中起到關鍵作用。

4 組織蛋白酶在其他疾病中的作用

4.1 組織蛋白酶與干燥綜合征(Sjogren syndrome,SS) 有相關研究發現,在SS患者淚液中存在有活性的Cat S,其活性大于RA、系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)和健康對照者淚液中Cat S的活性。SS患者淚液中發現的Cat S促進了乳鐵蛋白(LF)和分泌IgA(SIgA)這兩種豐富的淚蛋白的降解,這兩種蛋白在眼睛防御病原體方面都起著至關重要的作用[25]。

4.2 組織蛋白酶與系統性紅斑狼瘡 Cat S通過驅動MHC II類介導的T細胞和B細胞啟動、生發中心形成和B細胞向漿細胞成熟來促進SLE。這些傳入免疫途徑可以被Cat S拮抗劑RO5461111特異性逆轉,即使在疾病發作后給予Cat S拮抗劑,也能阻止SLE及狼瘡性腎炎的進展,這種新的治療策略可以糾正SLE及其他免疫復合物相關自身免疫性疾病的共同病理機制[26]。

4.3 組織蛋白酶與心血管及呼吸系統疾病 在心血管疾病中,有研究者認為，Cat S 和Cat B可作為心血管疾病的標志物,當血管平滑肌細胞受IL-1β和IFN-γ刺激時,會分泌Cat S,并降解不溶性彈性蛋白,進而破壞動脈粥樣斑塊在血管中的穩態。Cat S通過彈性蛋白的裂解和生物活性彈性蛋白肽的生成,促進心血管炎癥和鈣化。在心血管鈣化中,鈣和磷酸鹽的失衡以及Cat S的升高,可能會導致間充質細胞(包括血管SMCs和間質細胞)向骨軟骨源性或僵硬表型轉化[27],這種機制有助于鈣化主動脈瓣膜疾病的發展。

Cat S在呼吸系統疾病中也發揮一定作用,有研究發現,慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的發病機制與Cat S也有關系,Cat S在COPD患者的巨噬細胞和樹突狀細胞中高度表達。COPD患者支氣管肺泡灌洗液中Cat S水平和活性高于健康志愿者。肺氣腫小鼠模型的研究表明,Cat S促進肺部炎癥和破壞[28]。與COPD相比,先前的一項研究表明,哮喘患者與健康體檢者相比,血漿Cat S的水平反而更低。血漿Cat S和Cat S/胱抑素C(Cys C)比值與氣流阻塞的程度和肺氣腫的嚴重程度呈負相關[29]。

5 組織蛋白酶抑制劑

5.1 組織蛋白酶S的抑制劑 迄今為止,Cat S的靶向治療一直集中在Lip10上。在一項人類臨床研究中,Cat S抑制劑RO5459072的劑量在Lip10中表現出劑量依賴性的增加,并在體內顯示了預期的藥理學抑制作用。霍夫曼-拉羅什的研究旨在治療與MHC II肽負荷相關的自身免疫性疾病,證實了RO5459072是一種選擇性的、有效的、競爭性的口服抑制劑,其活性位點可以減少CD4 T細胞和樹突狀細胞的激活以及自身抗體的產生,在臨床前模型的自發性系統性紅斑狼瘡和狼瘡腎炎中有很明顯的效果[30]。

有研究顯示,特異性抑制劑RO5459072在PBMC體外抑制Cat S,導致Lip10在B細胞和mDC中積累,但在pDC中沒有,在單核細胞中只有很小程度的積累。抗原特異性激活CD4輔助T細胞和下游激活效應機制,如B細胞產生的自身抗體,在RA和SS等多種自身免疫性疾病的發病機制中的作用已得到證實。因此，抑制Cat S可能有效地治療炎癥Th1驅動、mDC或B細胞驅動的自身免疫過程,如銀屑病或多發性硬化癥,同時保持耐受性pDC功能[31]。

5.2 組織蛋白酶K的抑制劑 Cat K通過破骨細胞和滑膜成纖維細胞表達,降解骨和軟骨的關鍵成分,如I型和II型膠原蛋白、骨連接蛋白[28]。由于Cat K抑制劑(Cathepsin K inhibitors,CKIs)可以選擇性地抑制骨吸收,但對骨形成的影響較小,因此在之前的研究中,CKIs已被用于治療骨質疏松癥。Cat K在RA的滑膜成纖維細胞和巨噬細胞中高度表達。放射破壞的程度與Cat K的血清水平之間存在正相關的關系。抑制Cat K蛋白酶活性可能有助于預防RA的骨侵蝕和軟骨降解。CKIs可能抑制全身和局部骨質流失,改善關節炎,并降低骨強度下降的動物模型的關節炎[32]。

在體外實驗中,ONO-5334顯示出對Cat K的強選擇性抑制作用,并在骨質疏松模型中導致骨密度和骨強度的改善。Drake等[33]在臨床研究中調查了該化合物對絕經后婦女骨質疏松癥的療效和安全性,研究顯示，ONO-5334組和阿侖膦酸鈉組的腰椎、全髖關節和股骨頸的骨密度均顯著升高。

Cat抑制劑的研究,在一定程度上對于未來RA及許多其他自身免疫性疾病的治療有著重要意義,可實現早期診斷、早期治療的目的,減輕患者病痛,提高生活質量。

6 小結與展望

RA是風濕科眾多疾病中較為常見的病種之一,由于疾病后期會出現關節畸形、功能喪失等一系列影響患者生活質量的并發癥,早期干預顯得尤為重要。近幾年,Cat成為研究RA的熱點。Cat具有廣泛的生物學活性,參與了基質降解和炎癥反應的各個方面。在RA的動物實驗中,血清Cat S的表達遠高于對照組,其表達水平與RA疾病活動度(DAS-28)正相關,有自身抗體的患者的血清Cat水平均顯著高于無這些抗體的患者,RA患者SF中Cat水平明顯高于血清中的水平。Cat缺乏小鼠關節炎的嚴重程度降低,Cat S敲除小鼠關節炎的易感性降低,提示Cat抑制劑可能成為RA新的治療靶點,Cat S的特異性抑制劑LHVS和非特異性抑制劑E64,可能對軟骨細胞分泌的Ⅱ型膠原有抑制降解的作用。在Svelander等[34]在食蟹雌猴的研究中，發現抑制Cat K可減少膠原誘導的關節炎(CIA)[35]小鼠模型的骨侵蝕、軟骨退化和炎癥。ONO-5334是一種低分子量的Cat K合成抑制劑,可抑制關節破壞的進展,與甲氨蝶呤(MTX)同時使用可增強其效果,因此,ONO-5334與MTX聯合應用可能有助于治療RA。但由于觀察時間及生物物種等因素,加之Cat S同源性較高,對其他Cat可能也會產生抑制作用,而且許多抑制劑的特異性較低,因此,研究并開發一種特異性高、不良反應小的Cat S抑制劑是研究的難點。應用Cat拮抗劑治療RA能否達到理想的效果尚不明確,仍需對Cat的生物學特性及其在RA的發病機制中的作用深入研究,或許在將來對于RA的治療甚或治愈有著重要意義。