芍藥二酮對糖尿病視網膜病變大鼠血管損傷及NLRP3活性的影響

馮雪艷,張慧芹,李 幸,范玉香,劉時文

糖尿病性視網膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是一種以炎癥和血管生成途徑為特征的視網膜微血管疾病[1]。它是糖尿病最常見的并發癥,也是導致成人失明的主要原因之一[2]。越來越多的研究發現,糖尿病引起的視網膜損害與慢性低級別炎癥狀態下的相關通路和介質有關,這導致血視網膜屏障的通透性增加,導致缺血事件,驅動血管生成進入視網膜[3]。預計到2030年全球糖尿病患者總數將增加至3.66億人,成為全球健康的主要威脅之一。在糖尿病的血管并發癥方面,35%的糖尿病患者有某種形式的DR,7%的患者有增生性DR(Proliferative DR,PDR),7%的患者有糖尿病黃斑水腫,10%的患者處于視覺威脅階段[4]。因此,尋找有效預防DR的措施和治療藥物是目前研究的熱點。

芍藥二酮是一種從芍藥根中分離得到的新萜類化合物[5]，其具有抑制人單核細胞白細胞介素-1β(IL-1β)、環氧合酶(CO)、血栓烷A合成酶(TX)和5-脂氧合酶(LO)活性的作用[6]。近幾年有研究發現,芍藥二酮減輕了氧化應激和炎癥介導的血管和肝臟疾病[7]，而炎癥在DR發病機制中起著關鍵的作用[8]。因此,提示芍藥二酮可能對DR具有治療作用。

本研究旨在探索芍藥二酮對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病視網膜病變的治療效果和可能的作用機制,尤其是對視網膜血管炎性和血管通透性的影響，進一步為DR的臨床用藥提供更直接的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重180～220 g,購自河北省實驗動物中心。大鼠被置于受控環境(21～23 ℃,12 h光照/12 h黑暗周期,濕度55%～60%)中,以標準的鼠糧和隨意飲水喂養。所有動物實驗操作均嚴格遵循國家衛生研究院實驗室動物護理和使用指南中所述的方法。

1.1.2 藥品和試劑 芍藥二酮購自北京范德生物科技有限責任公司,需用檸檬酸緩沖液(pH=7.4)進行溶解。伊文思藍染料購自北京Solarbio公司,使用前將伊文思藍染料溶解在生理鹽水中，配制成濃度為45 mg/ml的溶液。戊巴比妥鈉購自中國北京國藥集團股份有限公司。熒光素(AK-FLUOR)購自Sigma公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司。SYBR Premix EX TaqTMI試劑盒購自TaKaRa公司。所有引物均在上海生工合成。一抗NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-1β)、凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、GAPDH抗體購自Abcam公司。一抗血小板-內皮細胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)、細胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和熒光二抗Alexa Fluor 568購自Thermo Fisher 公司。二抗Goat Anti-Rabbit IgG Antibody(H&L)購自金斯瑞生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立[9]隨機選取8周齡的SD大鼠40只進行造模,先給予高脂高糖的飼料連續喂養4周,4周后,大鼠禁食不禁水12 h,稱重并腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。STZ給藥48 h后,采集大鼠尾部靜脈血進行檢測,血糖超過16.7 mmol/L的大鼠為糖尿病,用于糖尿病大鼠模型。

1.2.2 分組及藥物干預 將造模成功的大鼠給予芍藥二酮灌胃治療。隨機分為4組(n=10),分別是模型組,芍藥二酮低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)劑量組,另設對照組(n=10),同時給予對照組和模型組等體積的檸檬酸緩沖液灌胃。每天1次,連續4周。

1.2.3 組織的收集 末次給藥24 h后,一部分小鼠經腹腔注射戊巴比妥酸進行麻醉處死,取其左右眼的視網膜組織,左眼的視網膜組織保存至-80 ℃,待后續蛋白質的收集;右眼的視網膜組織固定在4%的甲醛溶液中24 h,再進行15% EDTA脫鈣處理、酒精梯度(分別為100%、95%和70%)脫水、石蠟包埋、切片(3 μm),保存至4 ℃,待后續病理觀察使用。

1.2.4 大鼠視網膜組織病理形態觀察 冰凍切片在蘇木精溶液中染色5 min,用水沖洗。分色過程在鹽酸酒精溶液中進行,最后加水終止。在氨水溶液中進行發藍,加水終止發藍。切片浸泡在伊紅溶液中5 min,用水沖洗。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂固定封片,光學顯微鏡下觀察載玻片。測量全視網膜的厚度(內界膜和色素上皮之間)并計算神經節細胞層(GCL)細胞的數量(每100 μm細胞)。在每個半球的相鄰位置進行3次測量,9次測量取平均值。每組記錄3只眼的平均值作為代表值。對三組的結果進行統計分析。

1.2.5 大鼠視網膜組織血管通透性測量[10]采用熒光素檢測血管造影和伊文思藍評價各組大鼠的血管通透性。熒光素血管造影用托品酰胺眼液擴張瞳孔,氯胺酮和甲苯噻嗪深度麻醉大鼠后,腹腔注射150 μl AK-FLUOR(1% W/V)。視網膜血管滲漏用微米級IV成像。注射染料后5 min內拍照。為額外測量血管滲透量,大鼠通過尾靜脈注射100 μl伊文思藍染料,2 h后用CO2安樂處死老鼠,剝離眼球并仔細取出視網膜,放入含有100 μl甲酰胺的離心管中,在55 ℃下培養48 h,然后將離心管轉移到96孔板上,測量610 nm處的吸光度。

1.2.6 免疫熒光組織化學 將視網膜組織冰凍切片從4 ℃取出進行沖洗,再用檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)進行抗原去蔽。用1%牛血清白蛋白(BSA)和5%正常山羊血清在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中封閉載玻片上的組織切片,用PBS洗滌,與一抗NLRP3孵育2 h,稀釋1∶200。將載玻片洗凈,然后與相應的1∶500稀釋的二抗在適當的封閉液中孵育1 h,室溫置于黑暗中。用DAPI進行細胞核染色10 min,再用PBS洗滌,用含有淬滅劑的封片劑進行封片。在徠卡共聚焦顯微鏡下拍照,用Image J軟件對NLRP3熒光強度進行分析。每個視網膜切片隨機選擇5個視野。

1.2.7 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 使用Trizol試劑提取視網膜組織總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA質量,將A260/A280比值為1.8～2.0的RNA用于逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-Time PCR Master進行qRT-PCR。PCR反應條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 s,進行40個循環;60 ℃30 s，72 ℃ 30 s。擴增是一式3份進行。使用2-△△Ct法計算每個基因的相對表達水平(使用GAPDH作為內參)。所有引物序列如表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot法檢測 將保存在-80 ℃的視網膜組織取出放置冰上,用組織勻漿器進行研磨,加入RIPA裂解液于4 ℃裂解30 min,然后在4 ℃條件下,以20 000 g離心15 min。采用BCA蛋白濃度法測定上清的蛋白含量。將樣品與樣品緩沖液(4×sample buffer)煮10 min。使用10%～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白樣本,每泳道上樣10 μl進行電泳,然后轉膜,再予以下一抗進行孵育(4 ℃孵育過夜):Caspase-1、IL-1β、ASC、VEGF、PECAM-1、ICAM-1,再予相應的二抗室溫孵育1 h,用含有Tween 20的Tris緩沖鹽水洗滌印跡,最后用ECL顯影液進行顯影并拍片,用Image-J進行灰度分析。

1.3 統計學分析 所有統計分析均采用GraphPad Prism 6.0軟件進行。數據以平均標準誤差(SEM)表示,兩組之間的比較采用標準雙尾無配對t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芍藥二酮改善了糖尿病大鼠視網膜形態 在光學顯微鏡下,HE染色顯示,視網膜組織可明顯分為5層,分別是GCL(視網膜神經節細胞層)、IPL(內網狀層)、INL(內部核層)、OPL(外網狀層)和ONL(外顆粒層)。對照組大鼠視網膜表面光滑,GCL、INL和ONL層細胞排列緊密、整齊有規律；模型組視網膜內界出現明顯水腫,每一層分層異常,細胞排列疏松且無序,總視網膜厚度和GCL、INL、ONL層細胞密度顯著低于對照組;而相對于模型組,芍藥二酮中劑量組大鼠視網膜內界水腫明顯減輕,細胞排列相對整齊,總視網膜厚度和GCL、INL、ONL層細胞密度增多,而芍藥二酮低、高劑量組對糖尿病大鼠視網膜形態的改善效果不如中劑量組，見圖1。

圖1 大鼠視網膜組織HE染色

2.1 芍藥二酮改善了糖尿病大鼠視網膜血管通透性 為了研究芍藥二酮對糖尿病大鼠視網膜血管通透性的影響,我們檢測了血管造影并評價了各組大鼠的血管通透性。結果顯示,相比于對照組,模型組大鼠視網膜微血管滲漏增加;而相對于模型組,芍藥二酮低、中、高劑量組抑制了大鼠視網膜微血管滲漏,但芍藥二酮低、高劑量組對糖尿病大鼠視網膜血管通透性的改善效果不如中劑量組，見圖2。

圖2 大鼠視網膜組織伊文斯藍染色

2.2 芍藥二酮抑制了糖尿病大鼠視網膜組織中血管生成介質的增加 血管生成介質的表達與血管通透性和血管形成有關。因此,我們檢測了各組大鼠視網膜組織中血管生成介質PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達。qRT-PCR和Western blot結果顯示,與對照組相比,模型組血管生成介質PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達上調;而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組下調了PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達,其中芍藥二酮中劑量組變化最顯著，見圖3。

圖3 大鼠視網膜組織中血管生成介質的蛋白表達

2.3 芍藥二酮減少了糖尿病大鼠視網膜組織中NLRP3陽性細胞數量 炎癥是DR發病機制的關鍵因素,影響血管的形成[8]。因此,我們檢測了各組大鼠視網膜組織中NLRP3炎性小體蛋白的表達。免疫熒光組織化學染色結果顯示,NLRP3炎性小體主要在GCL和IPL層組成性表達。與對照組相比,模型組NLRP3陽性細胞增多;而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組NLRP3陽性細胞均減少,芍藥二酮中劑量組NLRP3陽性細胞數量顯著減少，見圖4。

圖4 大鼠視網膜組織中NLRP3的蛋白表達

2.4 芍藥二酮抑制了糖尿病大鼠視網膜組織中NLRP3炎性小體的激活 本研究檢測了各組大鼠視網膜組織中NLRP3炎性小體激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達。qRT-PCR和Western blot結果顯示,與對照組相比,模型組大鼠視網膜組織中Caspase-1、IL-1β、ASC的表達上調;而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組Caspase-1、IL-1β、ASC的表達下調,其中芍藥二酮中劑量組變化最顯著，見圖5。

圖5 大鼠視網膜組織中NLRP3炎性小體激活標志物的蛋白表達

3 討論

DR是糖尿病最常見的并發癥,也是全球糖尿病患者視力下降的主要原因[11]。臨床上,DR大致分為早期非增生性DR 和晚期增生性DR,伴有和不伴有糖尿病性黃斑水腫的發展[12]。DR涉及多個相互關聯的通路,炎癥就是其中之一,它會對視網膜的神經和血管成分產生不良影響。持續的炎癥會引起生化和分子的變化,最終導致糖尿病視網膜病變的并發癥和視力下降[13]。DR的病因和病理已經被廣泛研究,但其治療的選擇很少。因此,研究治療DR的藥物極其重要。

芍藥二酮是具有較強抑制人體IL-1β活性的一類新型萜類化合物,研究發現,它還是多種酶的抑制劑[5-6]。本研究初步探討了芍藥二酮對DR的保護作用及分子機制。研究發現,芍藥二酮可以改善DR模型大鼠的視網膜形態,包括改善了GCL、INL及ONL層分層和細胞排列紊亂,并抑制了全視網膜厚度和GCL、INL、ONL層細胞密度的降低;此外,芍藥二酮還改善了DR模型大鼠視網膜血管通透性,降低了視網膜微血管的滲漏,抑制了視網膜新生血管的形成。因此,芍藥二酮對DR誘發的視網膜組織損傷具有抑制作用。

本研究探討了芍藥二酮抑制DR大鼠視網膜組織損傷的分子機制。由于血管通透性和新生血管形成受血管生成介質PECAM-1、ICAM-1、VEGF的調控[14-16]，我們檢測了DR大鼠視網膜組織中血管生成介質的表達,發現芍藥二酮降低了血管生成介質PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達,由此降低了血管滲漏,抑制了視網膜血管的通透性和新生血管形成。此外,有研究報道,NLRP3炎癥小體相關的炎癥分子在糖尿病視網膜組織中表達增強,可能有助于糖尿病視網膜病變中新生血管形成[17]。NLRP3炎性小體,是由NLRP3、ASC和Caspase-1組成[18]。NLRP3成分識別危險信號,并將蛋白復合物ASC組裝起來激活Caspase-1,導致促炎性細胞因子IL-1β蛋白水解分泌,進而激活NLRP3炎性小體。最新研究表明,通過調節NLRP3炎性小體的激活，可以改善糖尿病視網膜病變[19]。為此,我們檢測了大鼠視網膜組織中NLRP3炎癥小體及其激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達。本研究結果顯示,芍藥二酮降低了NLRP3炎癥小體及其激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達,進而抑制了NLRP3炎癥小體的激活。因此,芍藥二酮抑制DR大鼠視網膜組織GCL細胞數量的減少和血管滲漏可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活實現的。

綜上所述,芍藥二酮改善了DR大鼠的視網膜組織形態和血管通透性,降低了DR大鼠視網膜組織中NLRP3炎癥小體激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC和血管生成介質PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達,可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活實現。