美洲大蠊配方顆粒特征圖譜方法建立

曾永禎，高 晗，孫福仁，田 方，李軍山 ，2*

(1.神威藥業集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司，云南 楚雄 675000)

美洲大蠊為蜚蠊科昆蟲，俗稱蜚蠊，又稱蟑螂、偷油郎等，是一種十分古老的昆蟲，最早以蜚蠊之名載于《神農本草經》[1]。現代藥理研究表明美洲大蠊具有促血管增生、組織修復、強心升壓、改善微循環、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎鎮痛、增強免疫等作用[2-4]，并且以美洲大蠊藥材為原料開發出了許多國家系列新藥，如：康復新液、心脈龍注射液、肝龍膠囊等。

美洲大蠊主要含氨基酸類和核苷類成分。根據大量實驗研究發現美洲大蠊中均含有17種以上氨基酸，其中包括7種必需氨基酸，2種半必須氨基酸和8種非必需氨基酸。核苷類有胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷等[5-7]。另外，美洲大蠊還含有蜚蠊酸、蟑螂油、過敏原成分、各種酶、細胞色素A、B、C、甲殼素、煙酸等。

近年來已有不少學者[8-10]，通過 HPLC或 UPLC法分析美洲大蠊藥材及其產品，為快速高效評價其質量提供了參考依據。本實驗采用HPLC法建立 3 批美洲大蠊配方顆粒的特征圖譜，并標定了尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷4個特征峰。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CPA225D電子分析天平(賽多利斯股份公司，德國)；KH-7200E超聲波清洗器(昆山禾創超聲波儀器有限公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津儀器設備有限公司)。

1.2 材料

美洲大蠊配方顆粒(云南神威施普瑞藥業集團有限公司，批號：1906151、1907241、1907284)。對照品：尿嘧啶(批號：100469-201302)，酪氨酸(批號：140609-201914)，次黃嘌呤(批號：140661-201704)，肌苷(批號：140669-201606)，均為中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和系統適用性實驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，以體積比3%甲醇溶液(含0.1%冰醋酸)為流動相B，檢測波長254 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃；以表1中的梯度洗脫條件進行檢測，理論板數按肌苷峰計算應不低于5 000。

表1 流動相洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備

稱取酪氨酸、尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含尿嘧啶0.05 mg、酪氨酸0.08 mg、尿嘧啶0.05 mg、次黃嘌呤0.1 mg、肌苷0.1 mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入85%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率150 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用85%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液15 mL，水浴蒸干，殘渣加水適量使溶解，轉移至10 mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 測定法

分別吸取對照品溶液、供試品溶液各5～10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。具體見圖1。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取美洲大蠊配方顆粒，按照上述供試品溶液制備方法制備美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，進樣6次，結果各主要特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD為0.04%～2.48%之間，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取美洲大蠊配方顆粒，按照上述供試品溶液制備方法制備美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，分別于制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時檢測，結果各主要特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD為0.15%～1.70%之間，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.6.3 重復性試驗 取美洲大蠊配方顆粒，按照上述供試品溶液制備方法制備美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，依法測定，結果各主要特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD為0.13%～1.96%之間，表明方法重復性良好。

2.6 樣品測定

取美洲大蠊配方顆粒適量，照“2.4”項下制備供試品溶液。另取尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷對照品適量，照“2.3”項下方法制備對照品溶液。按上述色譜條件進樣，記錄尿嘧啶、酪氨酸、尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷保留時間，計算相對保留時間，結果見表2。

注：對照品溶液(A)(1：尿嘧啶 2：酪氨酸 3：次黃嘌呤 5：肌苷)。

注：美洲大蠊配方顆粒樣品(B)。

表2 3批美洲大蠊配方顆粒特征圖譜測定結果

由表2可知，美洲大蠊配方顆粒特征圖譜有7個特征峰，與次黃嘌呤對照品參照物相對應的峰為S峰，計算相對保留時間，RSD<2.0%，故規定：其他特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應在規定值的±10%范圍內，規定值為：0.74(峰1)、0.95(峰2)、1.05(峰4)、1.11(峰5)、1.24(峰6)、1.50(峰7)。

3 討論

本實驗對美洲大蠊配方顆粒樣品進行全波長掃描，比較不同波長下色譜圖的峰數目與分離效果。結果表明，在254 nm波長下美洲大蠊配方顆粒的峰數目較多且分離度良好，且溶劑峰影響小，因此將254 nm作為美洲大蠊配方顆粒特征圖譜的檢測波長。

本研究建立了美洲大蠊配方顆粒的特征圖譜測定方法，并標定了尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷4個特征峰，測定了3批美洲大蠊配方顆粒的特征圖譜，方法科學、穩定、可靠。為美洲大蠊的產品提供了科學的評價指標，同時為完善美洲大蠊的質量標準奠定了良好的基礎。