絞股藍飲片的質量標準研究

李妮勵，梁永娟，黃千禧，黎 欣，林青華，2*

(1.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200)

絞股藍又名七葉膽，為葫蘆科植物絞股藍Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的干燥全草[1]，因絞股藍部分皂苷結構與人參皂苷相似，因而又被稱作“南方人參”[2]。其性寒，味苦、微甘，歸脾、肺、腎經，具有清熱解毒、止咳祛痰、益氣養陰、延緩衰老的功效[3-4]，是廣西地區壯醫、瑤醫的習用品種?，F代研究[5-7]表明，絞股藍含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等多種化學成分，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、調節免疫力等多種藥理活性，臨床常用于治療糖尿病、慢性支氣管炎、腎盂腎炎等多種疾病[8-10]。

絞股藍始載于《救荒本草》[11]，現被廣西、天津、上海、浙江、安徽、福建、江西、湖南、四川等地的中藥飲片炮制規范收載[12]。但絞股藍在《廣西壯族自治區中藥飲片炮制規范》(2007年版)及《廣西壯族自治區瑤藥材質量標準：第一卷》中僅有性狀特征和莖橫切面顯微特征的描述，再無其他質量要求。這不利于絞股藍飲片的質量控制與評價，如葡萄科植物烏蘞莓Cayratiajaponica(Thunb.) Gagnep的外觀就與其較為相似，肉眼難以區分，極易混淆[13]，因此對絞股藍飲片的質量標準開展研究很有必要，可滿足其質量控制與評價的要求。故本研究根據2020版《中華人民共和國藥典：四部》[14](下文稱《藥典》)的相關規定，對10批不同產地的絞股藍飲片進行定性鑒別(性狀、粉末、薄層色譜)與定量研究(水分、灰分、浸出物、含量測定)，以期建立絞股藍飲片的質量標準，為其質量控制與評價提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

10批不同產地的絞股藍藥材經廣西中醫藥大學藥用植物教研室朱意麟老師鑒定為葫蘆科植物絞股藍Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的干燥全草，見表1。絞股藍皂苷XLIX對照品(批號MUST-19112910，純度>98.0%)、人參皂苷Rb1對照品(批號MUST-19060116，純度>98.0%)均購于成都曼斯特生物科技有限公司，蘆丁對照品(批號：190328，純度>98.0%)、槲皮素對照品(批號：190331，純度>98.0%)均購于上海融禾醫藥科技有限公司。

表1 10批絞股藍藥材編號與來源

1.2 儀器

LC-2030 Plus高效液相色譜儀(日本島津公司)，Ultimate?XB-C18色譜柱(月旭科技(上海)股份有限公司)，色譜乙腈(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，Direct-Q5UV超純水儀一體機(廣西南寧博美生物科技有限公司)，KQ-500E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，硅膠G板(青島海洋化工有限公司)，磷酸、甲醇為分析純。

2 方法

2.1 性狀鑒別

10批絞股藍藥材噴淋適量清水軟化，切成長度為1 cm的段，干燥；按《藥典》通則“0212藥材和飲片檢定方法”對飲片形狀、大小、顏色、表面、質地、斷面及氣味進行描述。

2.2 顯微鑒別

2.3 薄層色譜鑒別

取絞股藍飲片粉末(過五號篩)2 g，加80%的甲醇40 mL，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加80%甲醇2 mL溶解，即得供試品溶液；取蘆丁和槲皮素對照品各1 mg，分別加80%的甲醇制成每1 mL含0.1 mg的蘆丁對照品溶液及槲皮素對照品溶液，備用。

按照《藥典》通則“0502薄層色譜法”規定，吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴3% AlCl3乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。置365 nm紫外燈下觀察。

2.4 水分、灰分和浸出物的測定

按照《藥典》通則“0832水分測定法(烘干法)”“2302灰分測定法”“2201浸出物測定法(水溶性浸出物，熱浸法)”的要求，分別對絞股藍飲片的水分、總灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物進行測定。

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 取絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含絞股藍皂苷XLIX 0.131 mg及人參皂苷Rb10.099 mg的混合溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 取絞股藍飲片粉末(過五號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，密塞，稱定重量，放置30 min，時時振搖；超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足損失重量，搖勻，濾過，精密移取續濾液10 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 Ultimate?XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～5 min，20% A；5～15 min，20%～40% A；15～20 min，40% A，20～21 min，40%～20% A；21～35 min，20% A)；流速1 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波203 nm。

2.5.4 方法學考察 線性關系考察：精密吸取0.125 mL、0.50 mL、3 mL、4 mL、6 mL “2.5.1”項下的對照品溶液分別置10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液置液相小瓶中，按“2.5.3”項下色譜條件依次吸取10 μL進樣分析，并以峰面積(A)為縱坐標，濃度(μg/mL)為橫坐標，分別計算絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的回歸方程及線性范圍。

精密度考察：取“2.5.4”項下的同一濃度對照品溶液，按“2.5.3”項下色譜條件連續進樣6次，按峰面積計算絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的相對準偏差(RSD)。

魯迅“從這搏斗的危險、緊張、艱難中感到活躍的生命力、感到生活的充實，產生唯有斗士才能體驗的幸福感?！盵4]160他認為“死者倘不埋在活人的心中，那就真真死掉了”。[7]280“唯獨革命家，無論他生或死，都能給大家以幸福?！盵9]410正如馮雪峰在《魯迅回憶》中說“現實戰斗的意志、需要和目的，決定著和統一著魯迅先生的全部思想”。真誠、抗爭的人生態度，斗士的生存方式和價值取向，使魯迅的散文體現出冷峻剛毅的風格。

重復性試驗：取JGL-20190623號絞股藍樣品按“2.5.2”項下方法，平行制備6份供試品，按“2.5.3”項下色譜條件進樣，并按峰面積計算絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值。

穩定性試驗：取JGL-20190623號絞股藍樣品按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h按“2.5.3”項下色譜條件進樣，并按峰面積計算絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值。

加樣回收試驗：取已知含量的絞股藍樣品(絞股藍皂苷XLIX為1.02%、人參皂苷Rb1為0.31%)按“2.5.2”項下方法，平行制備6份供試品，分別向其加入定量的絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1對照品，按“2.5.3”項下色譜方法進樣，并計算絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的回收率及RSD值。

樣品含量測定：取各批絞股藍飲片，分別按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，根據“2.5.3”項下色譜條件進樣，并分別計算各樣品中絞股藍皂苷XLIX及人參皂苷Rb1的含量。

3 結果

3.1 性狀鑒別

絞股藍飲片呈不規則段狀。莖類圓柱形，具細縱棱，直徑1～2 mm，表面黃綠色或淡綠色，被短柔毛或近無毛，質韌，不易折斷，斷面不平坦，髓部微白；卷須二叉或不分叉，側生于葉柄基部；葉互生，薄紙質或膜質，皺縮，易碎落，完整葉片潤濕后展開呈五葉或七葉鳥足狀，小葉呈卵狀長圓形或長圓狀披針形，中央小葉常3～12 cm，寬1.5～4 cm，葉端漸尖，葉基楔形，葉緣鋸齒狀；圓錐花序纖細；花細小，常脫落；果實球形，無毛，直徑約5 mm，成熟時呈黑色；種子寬卵形，兩面具乳狀凸起。氣微，味苦微甘，嚼之有纖維性。見圖1。

圖1 絞股藍飲片(A)及其復葉與果實[15](B)

3.2 顯微鑒別

絞股藍飲片粉末為淺綠色。纖維眾多，淺綠色，長約100～400 μm，常單個散在或聚集成束，呈長梭形，晶鞘纖維易觀察，方晶明顯，散布在纖維中央或兩邊。草酸鈣簇晶散在細胞中，形似荷花，草酸鈣針晶成束存在。石細胞類菱形，呈棕黃色，三面增厚，層紋清晰，孔溝明顯，散在或成團，有些依附于纖維上。少量表皮可見不定式氣孔，呈開放或閉合狀態。導管眾多，有具緣紋孔導管及螺旋導管。腺毛、非腺毛隨處可見，腺毛的節與節間明顯，形似掃帚，腺頭多破碎不完整；非腺毛呈圓錐形，較細長，一般為3～14個細胞構成，長120～360 nm。晶體散落在基質中。淀粉粒較多，呈腎型、人字形、圓形或橢圓形，多為單?；驈土?。還有少量多糖團塊，偶見微量油滴。見圖2。

注：1.草酸鈣簇晶；2.草酸鈣針晶；3.石細胞；4.氣孔；5.具緣紋孔導管；6.晶鞘纖維；7.纖維；8.非腺毛；9.腺毛；10.晶體；11.油滴；12.淀粉粒；13.多糖團塊。

3.3 薄層色譜鑒別

薄層色譜鑒別見圖3。圖3結果表明，槲皮素對照品、蘆丁對照品分別與各供試品在硅膠G板的相應位置上，顯淺綠色熒光斑點，但不同供試品間熒光斑點大小有差異，說明各樣品中槲皮素、蘆丁的含量不同。

注：1～5、8～12為絞股藍供試品；6.槲皮素對照品；7.蘆丁對照品。

3.4 水分、灰分和浸出物的測定

絞股藍飲片的水分、灰分及水溶性浸出物的測定結果見表2。由表2結果可知，絞股藍飲片的水分含量為9.64%～11.19%，總灰分含量為8.95%～12.84%，酸不溶性灰分含量為0.17%～1.51%，水溶性浸出物的含量為22.21%～32.26%。根據上限值上浮動20%的原則，擬定絞股藍飲片水分、總灰分和酸不溶性灰分的限量值分別不得超過13.0%、15.0%、2.0%；根據水溶性浸出物下限值的80%擬定絞股藍飲片中水溶性浸出物的含量不得低于18.0%。

表2 絞股藍飲片中水分、總灰分、酸不溶性灰分與水溶性浸出物含量

3.5 含量測定

絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1混合對照品及絞股藍飲片供試品的高效液相色譜見圖4。

線性關系考察結果表明，絞股藍皂苷XLIX及人參皂苷Rb1的回歸方程分別為YXLIX=1 620 741X+ 12 436(r=0.999 6)和YRb1=1 097 240X+ 1 431(r=0.999 4)，說明絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1分別在1.64～78.60 μg/mL、1.24～59.40 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好。精密度考察結果表明，絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值分別為1.64%、1.97%，說明儀器精密度良好。重復性試驗結果表明，絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的平均含量分別為1.02%、0.31%，其RSD值分別為1.48%、1.73%，說明該方法重復性良好。穩定性試驗結果表明，絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的RSD值分別為1.97%、1.84%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。由加樣回收試驗結果可知，絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1加樣回收率的平均值分別為100.16%、100.21%，其RSD值分別為1.40%、0.95%，見表3。方法學考察結果表明，選定的高效液相色譜條件可靠、穩定，可用于絞股藍飲片中絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量測定。

注：1.人參皂苷Rb1；2.絞股藍皂苷XLIX。

表3 絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1加樣回收試驗結果

10批絞股藍飲片中絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量見表4。由表4結果可知，10批絞股藍飲片中絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量分別為0.12%～0.98%及0.02%～0.30%。按照含量下限值的80%制訂其限量標準，擬定絞股藍飲片中絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1的含量分別不得低于0.10%、0.01%。

表4 10批絞股藍飲片中絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1含量

4 討論

4.1 薄層色譜法

本實驗在薄層色譜鑒別過程中，分別考察了溶劑(甲醇、80%甲醇)和展開劑(乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸、乙酸乙酯-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-水、正丁醇-乙酸乙酯-水、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水)對展開效果的影響，結果發現當采用甲醇為溶劑制備的樣品在展開過程中會出現拖尾現象，而采用80%甲醇制備樣品則無拖尾現象，故采用80%的甲醇為溶劑制備樣品；在考察的眾多展開劑中，只有以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑時才能使蘆丁、槲皮素的斑點清晰，故選擇乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)作為展開劑。

4.2 高效液相色譜法

本實驗在高效液相色譜條件的選擇過程中，分別考察了流動相(乙腈-純水、乙腈-0.2%磷酸水)、波長(203 nm、210 nm)、柱溫(30 ℃、40 ℃)、提取方法(超聲法、回流法)、提取溶劑(甲醇、80%甲醇)等因素對絞股藍皂苷XLIX、人參皂苷Rb1分離度及峰面積的影響，結果發現絞股藍樣品的最佳提取方式為甲醇超聲提取，流動相以乙腈-0.2%磷酸水梯度洗脫為宜，最佳波長及柱溫分別為203 nm、30 ℃。

5 結論

本實驗所建立的絞股藍飲片定性、定量研究方法，可為絞股藍飲片質量標準的制定提供參考及實驗依據。