HPLC測定梔黃消瘀止痛膏中大黃酚含量

魯明明，林新艷，鄔學群，莫 文，許金海，范趙翔，湯茹茹，殷書梅*

(1.江蘇康緣陽光藥業有限公司，江蘇 南京 210046；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032)

梔黃消瘀止痛膏是在我國著名武術傷科大師王子平的經驗方基礎上改進而成的橡膠膏劑，處方由大黃、梔子、乳香、地鱉蟲等六味中藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛的功效。臨床用于跌打損傷初期、運動后急性軟組織損傷、骨折腫痛劇烈屬氣滯血瘀證，證見以踝膝肘腕等關節腫痛為甚者，患者可在傷處出現青紫瘀斑或血腫，關節腫脹、活動受限等[1-2]。原制劑為軟膏，臨床采用藥粉和飴糖攪拌均勻后直接涂布貼敷，不適宜長期存放，且患者反饋清潔度不佳，攜帶不方便。本制劑對處方藥材進行合理提取后選用適宜基質形成橡膠膏劑，更符合臨床需要。方中以大黃作為君藥，其化學成分包含游離蒽醌衍生物、結合狀蒽醌衍生物以及番瀉葉苷A、B、C等，此外還含有鞣質類、有機酸類、揮發油類及植物甾醇等[3-4]。大黃臨床上具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經之功效。本制劑選擇活性成分大黃酚作為制劑質量控制指標，并建立了一種測定梔黃消瘀止痛膏中大黃酚含量的色譜方法，可對指標成分進行定量控制從而確保產品質量穩定及有效。現將實驗過程報道如下。

1 實驗材料

儀器：Agilest 1200(四元泵，VWD檢測器)；Mettler AG135電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，十萬分之一)；Mettler AB135S電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，十萬分之一)；恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司，型號HH-2)；超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司，型號KQ-500DE)；旋轉蒸發儀(德國艾卡，型號IKA RV10)。試劑：甲醇-分析純(南京化學試劑200106022H)；乙醇(南京化學試劑200211160H)；氯仿(南京化學試劑20115126D)；鹽酸(南京化學試劑170811285H)；磷酸(南京化學試劑170310536D)；純凈水。對照品：大黃酚對照品(批號110796-201922，純度99.4%，供含量測定，中國食品藥品檢定研究院)。樣品：梔黃消瘀止痛膏(批號：200501、200502、200503，江蘇康緣陽光藥業有限公司生產)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參照《中國藥典》[5]2015年版一部“大黃藥材含量測定”項下總蒽醌含量測定方法，對高效液相色譜條件進行優化，最終選定的色譜條件為：色譜柱島津Wondasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為35 ℃，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，理論塔板數不低于3 000。色譜見圖1、圖2。

圖1 對照品大黃酚色譜

圖2 供試品溶液色譜

2.2 供試品制備方法

取貼膏2片，蓋襯除去后將藥膏刮下，混勻，取0.5 g，精密稱定后置入具塞錐形瓶內，加入25 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，減失的重量以甲醇補足，搖勻，濾過。精密移取提取液5 mL置入燒瓶中，將乙醇揮去，加入10 mL鹽酸溶液(8%)，超聲2 min，加入三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，取出，待冷后置入分液漏斗，燒瓶用適量三氯甲烷進行洗滌，轉移至分液漏斗，分取三氯甲烷層，剩余酸液再用三氯甲烷提取3次，10 mL/次，合并三氯甲烷液，減壓回收，殘渣以甲醇溶解定容至10 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取大黃酚對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，搖勻，配制成每1 mL含16.27 mg的儲備液。精密吸取儲備液，用甲醇作溶劑，配制成濃度為4.068、8.135、16.27、32.54、65.08 μg/mL的系列標準溶液。在“2.1”項色譜條件下(色譜柱為Wondasil，柱號為7H9701-21)，進樣10 μL，重復2次，測定峰面積。以進樣濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行回歸計算，即得大黃酚的線性回歸方程為：Y=44.098X+0.567 9，相關系數R2= 1。實驗結果表明：大黃酚在4.068～65.08 μg/mL濃度范圍內呈良好線性，結果見表1。

表1 大黃酚的線性關系考察結果

2.3.2 精密度試驗 精密吸取含大黃酚濃度為16.27 μg/mL的對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下，注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，每次10 μL，測定峰面積，計算相對標準偏差(RSD)為0.2%，儀器精密度良好，結果見表2。

表2 精密度試驗結果 (n=6)

2.3.3 重復性試驗 取樣品1 g，精密稱定，平行6份，制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算得出6份樣品中大黃酚含量測定結果的RSD值為1.1%，顯示重復性良好，結果見表3。

表3 重復性試驗結果

2.3.4 穩定性試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液一份，分別在0、2、4、8、12、24 h依次注入高效液相色譜儀，記錄大黃酚的峰面積，計算測定結果的RSD值為1.3%。實驗結果表明：供試品溶液在24 h內穩定，結果見表4。

表4 供試品溶液穩定性考察結果

2.3.5 加樣回收率試驗 取本品(大黃酚含量1.66 mg/g)約1 g，平行9份，精密稱定。上述樣品每3份分為1組，每組分別按含大黃酚含量的0.5倍、1.0倍、1.5倍準確加入大黃酚對照品溶液，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，并記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD值。實驗結果表明：大黃酚的加樣回收率結果良好，結果見表5。

表5 加樣回收率試驗結果

2.4 樣品含量測定

分別取3批中試梔黃消瘀止痛膏(批號：200501、200502、200503)各約1 g，精密稱定，按“2.2”項下條件制備供試品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算制劑中大黃酚的含量，結果見表6。

表6 三批梔黃消瘀止痛膏中大黃酚的含量

3 討論

流速考察：在流速分別為0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min，其余色譜條件不變，對供試品溶液進樣考察，結果表明，供試品溶液中的大黃酚色譜峰在上述三種流速下均能較好分離，說明不同流速條件下的耐用性較好；柱溫考察：在柱溫分別為30 ℃、35 ℃和40 ℃，其余色譜條件不變，對供試品溶液進樣考察，結果表明，供試品溶液中的大黃酚色譜峰在上述三種柱溫下的分離度無影響，說明不同溫度的耐用性較好；色譜柱考察：在“2.1”項色譜條件下，選用不同品牌的色譜柱(Kromasil 100-5 C18、Epic C185u、Wondasil C18)，對供試品溶液進樣考察，結果表明，分離度、理論塔板數均能夠滿足要求，說明耐用性較好；在大黃酚的含量測定中，分別考察了流動相甲醇-0.1%磷酸的比例95∶5、90∶10、85∶15及80∶20，分別進樣分析，甲醇-0.1%磷酸(80∶20)流動相進樣分析的色譜圖中大黃酚的峰可以達到很好分離，且峰型較好。故選擇確定流動相為甲醇-0.1%磷酸(80∶20)。檢測波長選擇：在紫外分光光度計下對大黃酚對照品溶液進行掃描，大黃酚最大吸收波長在220～230 nm區間內有最大吸收，但樣品供試品溶液成分復雜，為避免其他物質影響，最終選擇2015版藥典“大黃”項下總蒽醌含量測定的波長254 nm，作為本方法的檢測波長。

《本草新編》記載大黃性甚速，走而不守，善蕩滌積滯、調中化食、通利水谷、推陳致新、導瘀血、破癥結、散堅聚、止疼痛、敗癰疽熱毒、消腫脹，俱各如神。《日華子本草》提及大黃可“調血脈，利關節，泄塑滯”，外敷用于各類瘡癤癰毒。歷代醫家以及《神農本草經》《綱目》《藥性論》等對大黃的應用均有詳細闡述：①積滯便秘；②血熱吐衄，目赤咽腫：本品性味苦寒能降，可下泄上炎之火，具清熱瀉火、涼血止血之功；③跌撲損傷、熱毒瘡瘍及水火燙傷；④瘀血證：下瘀血，清瘀熱，能活血逐瘀通經，為臨床骨傷科常用藥物；⑤濕熱證、淋證。文獻報道大黃蒽醌類成分有較強的抑制PGE2及抑制MAPK級聯系統的作用，表明大黃可通過抑制PGE2生成而產生抗炎作用[6]。另有報道，大黃外用具有顯著的消炎、鎮痛、抗菌等作用。本試驗采用HPLC法對制劑中大黃酚成分開展了方法學考察，建立了適宜的色譜方法，通過三批中試樣品進一步驗證了大黃酚含量測定的穩定性。本試驗樣品200501-200503批次因使用的是同一批中間體生產，本品大黃酚含量為1.62 mg/g，考慮到轉移率等問題，建議將含量初定為1.50 mg/g。后期跟進積累3～5批大黃原料所生產成品大黃酚含量，再確定具體值。同時對大黃原料及中間體分別建立內控標準，以確保產品質量的穩定性。