唐梔子提取物對腦出血大鼠認知及運動功能的影響

遲 棟，陳永祥

(1.南陽醫學高等專科學校，河南 南陽473000；2.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州450008)

唐梔子環烯醚萜苷是從河南省唐河縣特產唐梔子中提取出的有效成分，包括山梔子苷、異梔子苷、去羥梔子苷等。研究[1-2]證實，梔子環烯醚萜苷可抑制腦出血后腦損傷，減輕腦水腫癥狀，降低腦出血病死率，但其治療腦出血的具體機制尚未闡明。本研究通過建立腦出血大鼠模型，觀察唐梔子環烯醚萜苷對腦出血大鼠認知及運動功能的影響，并分析其可能的作用機制，為進一步研究提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只健康SPF級雄性SD大鼠，3月齡，體質量(200±20)g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，合格證號：0001507。在室溫22～24 ℃，相對濕度45%～55%環境中適應性飼養1周，自由進食飲水，12 h交替光照，處理方法遵守動物倫理原則。

1.2 藥品與主要儀器

唐梔子環烯醚萜苷購自西安佰斯特生物科技有限公司，含量98%(HPLC法)，批號：20190311；Ⅳ型膠原酶(Sigma)；鼠抗Caspase-3、Bax、Bcl-2單克隆抗體(Novus)；鼠抗GADPH單克隆抗體(LSBio)；辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗(上海一基生物有限公司)；垂直電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀(UVP)。

1.3 分組與建模

60只SD雄性大鼠通過雙盲法分為假手術組、模型組、唐梔子環烯醚萜苷低、中、高劑量組，每組12只。采用Ⅳ型膠原酶制備腦出血大鼠模型[3-5]，術前大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥(300 mg·kg-1)，將大鼠麻醉后固定。常規皮膚消毒并將前鹵充分暴露，采用牙科鉆在中線右3 cm處磨取1 mm骨窗，微型注射器進針5 mm注入0.1 mLⅣ型膠原酶(0.3 U·μL-1)，1 min內注射完畢。留針5 min，退針至硬腦膜后留針2 min，之后完全退針，并縫合切口。大鼠蘇醒后須單籠飼養。模型組與唐梔子環烯醚萜苷低、中、高劑量組通過上述方法建模，假手術組同上述操作但不注射Ⅳ型膠原酶。術后參考Longa評分法[6]篩選動物模型，無神經功能缺損記為0分；前爪無法完全伸展，表現出輕度神經功能缺損記為1分；行走時向癱瘓側轉圈，表現出中度神經缺損記為2分；行走時向癱瘓側傾倒，表現出重度神經功能缺損記為3分；無法行走，喪失意識記為4分。評分1～3分表示建模成功，剔除建模失敗與死亡大鼠，最終各組均保留10只大鼠進行后續實驗。

1.4 給藥治療

建模1 d后，唐梔子環烯醚萜苷低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射7.5、15、30 mg·kg-1劑量的唐梔子環烯醚萜苷，假手術組與對照組則注射等量生理鹽水，連續治療1周。治療期間通過Morris水迷宮實驗觀察大鼠認知功能變化，通過平衡木行走實驗觀察大鼠運動功能變化。治療1周后，將大鼠麻醉取出腦組織檢測腦組織含水量，采用Western blot法檢測病灶組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平。

1.5 Morris水迷宮實驗

準備內徑約160 cm的Morris水迷宮圓形池，水池內水深30 cm，水溫23～25 ℃，水池內壁涂黑，將其劃分為面積相同的4個象限，并隨機選取任一象限設置水下隱蔽平臺(水面下1 cm)。給藥1 d后各組大鼠進行定位巡航實驗，將大鼠面向池壁從隨機象限入水點放入池中，記錄大鼠找到水下隱蔽平臺并站立(停留至少3 s)所需時間(逃避潛伏期)。若大鼠入水后2 min內未能找到隱藏平臺，則用長棍將大鼠誘導至平臺，令其在平臺上站立30 s，此時，逃避潛伏期記為2 min。連續測量5 d，第6天將水下隱蔽平臺撤除，進行空間探索實驗，記錄2 min內大鼠穿越平臺位置的次數。

1.6 平衡木行走實驗

準備一長80 cm，寬2.5 cm的平衡木，放置于距水平面10 cm處，將大鼠放置于平衡木上，根據大鼠表現記錄評分。大鼠在平衡木上站穩持續2 min記為1分；大鼠在平衡木上站立并左右搖晃但未跌落持續2 min記為2分；大鼠在平衡木站立時間超過30 s但不足2 min即跌落記為3分；大鼠在平衡木站立不足30 s即跌落記為4分；大鼠無法站立，立即從平衡木跌落記為5分。

1.7 腦組織含水量檢測

麻醉處死大鼠后將其腦組織分離，剝去小腦、腦干、嗅球等部分后稱取濕重(W)，稱重后放入恒溫干烤箱內，110 ℃烘烤24 h后稱取干重(D)，腦含水量=(W-D)/W×100%。

1.8 Western blot法蛋白表達水平檢測

取適量病灶組織研磨制備成勻漿，加入蛋白抽提試劑置于冰上裂解30 min。離心取上清液，調整蛋白濃度后加入Buffer變性后上樣進行電泳。孵育、轉膜、顯色、成像并進行結果分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠認知功能比較

各組大鼠逃避潛伏期均表現出隨時間變化而不斷縮短的趨勢，模型組大鼠3 d起逃避潛伏期均明顯長于假手術組(P<0.05)，穿越平臺次數明顯少于假手術組(P<0.05)，提示腦出血會影響大鼠的認知功能。與模型組比較，唐梔子環烯醚萜苷中、高劑量組大鼠3 d起逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，穿越平臺次數明顯增多(P<0.05)，提示唐梔子環烯醚萜苷可改善腦出血大鼠認知功能。見表1、表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期時間比較

表 2 各組大鼠穿越平臺次數比較

2.2 各組大鼠運動功能比較

模型組大鼠平衡木行走實驗評分持續升高，2 d起明顯高于假手術組(P<0.05)，提示腦出血會影響大鼠的運動功能。唐梔子環烯醚萜苷各劑量組大鼠平衡木行走實驗評分持續升高，在3 d達到峰值并逐漸下降，3 d起唐梔子環烯醚萜苷中、高劑量組大鼠平衡木行走實驗評分均明顯低于模型組(P<0.05)，提示唐梔子環烯醚萜苷可改善腦出血大鼠運動功能。見表3。

表3 組大鼠平衡木行走實驗評分比較

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，唐梔子環烯醚萜苷各劑量組大鼠腦組織含水量明顯下降(P<0.05)，提示唐梔子環烯醚萜苷可有效改善腦出血腦水腫癥狀。見表4。

表4 各組大鼠腦組織含水量比較

2.4 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

與假手術組比較，模型組Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯上調(P<0.05)，Bcl-2表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，唐梔子環烯醚萜苷各劑量組Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，Bcl-2表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

3 討論

腦出血發生時病灶部位由于炎性浸潤會產生大量炎性因子、氧自由基等毒性代謝產物，從而損害神經元細胞并誘導細胞發生凋亡[7]。細胞凋亡是不同于程序性死亡的另一種形式，主要受相關基因調控[8]。Caspase家族介導并執行細胞凋亡，Caspase-3則參與細胞凋亡通路的核心環節。

注：A假手術組；B模型組；C唐梔子環烯醚萜苷低劑量組；D唐梔子環烯醚萜苷中劑量組；E唐梔子環烯醚萜苷高劑量組

Caspase-3被激活后可對不同底物進行切割并促使細胞核固縮，導致神經元DNA發生斷裂并抑制細胞增殖[9]。Caspase-3蛋白表達水平上調不僅表示細胞凋亡加劇，也是出血性腦損傷的重要標志[10]。在哺乳動物細胞凋亡過程中，Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制因子與Bax、Bak等促凋亡因子也起著至關重要的調控作用[11]。Bcl-2可調控線粒體外膜通透轉運孔道復合體阻止促凋亡蛋白釋放，從而抑制細胞凋亡進程。Bax受到凋亡信號刺激被激活后會發生磷酸化進入線粒體內，并與Bcl-2形成二聚體形成Bax大孔通道，與Bcl-2等蛋白發生對抗，發揮促凋亡作用[12]。故觀察病灶組織Caspase-3、Bax、Bcl-2表達水平，即可直接反映腦出血大鼠細胞凋亡程度。

涂鄂文等[13]設計了腦出血大鼠實驗觀察槲皮素對大鼠神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，發現槲皮素可以增加Bcl-2/Bax蛋白比值，從而抑制神經細胞凋亡，減輕大鼠神經損傷，槲皮素可提高病灶組織過氧化物歧化酶活性并降低丙二醛含量，從而減少氧自由基誘導的細胞凋亡過程。潘冬梅等[14]采用黃芪甲苷對高血壓腦出血大鼠實施干預，發現其可減輕高血壓腦出血大鼠氧化應激反應，改善大鼠神經行為學缺陷。郭輝等[15]發現，黃芪總皂苷能保護腦出血大鼠神經功能并減輕大鼠腦水腫程度，認為其機制在于抑制細胞凋亡。可見，抑制神經細胞凋亡是保護腦出血大鼠神經功能，減輕腦損傷的重要機制。

環烯醚萜苷是梔子藥材中的有效化學成分，具有清熱抗炎等藥理作用，梔子苷(京尼平苷)是其中的代表成分[16]。動物學研究[17]表明，給予大鼠60 mg·kg-1京尼平苷灌胃，在腎臟中檢出最高濃度，其次為肝、脾、腦。而且京尼平苷入腦后主要分布在神經遞質較為豐富的海馬部位[18]，為環烯醚萜苷治療各類腦損傷疾病奠定了基礎。現代藥理研究證實，梔子在神經保護、抗炎、抗氧化應激等方面均有一定的活性。曹靜等[19]發現，梔子苷可以提高大鼠在Y迷宮中的學習與記憶能力。步楠等[20]發現，梔子苷可有效緩解潰瘍性結腸炎模型大鼠疾病癥狀并抑制炎性因子表達水平。因此，猜測環烯醚萜苷治療腦出血大鼠也會有一定效果，故設計動物學實驗探究其可能的作用機制。結果表明，腦出血發生后大鼠腦組織含水量增加，且認知及運動功能均明顯下降，Caspase-3、Bax蛋白表達水平上調，Bcl-2表達水平明顯降低提示細胞凋亡加劇。給予大鼠唐梔子環烯醚萜苷干預后，大鼠Caspase-3、Bax蛋白表達水平明顯下降，Bcl-2表達水平明顯升高，大鼠認知及運動功能明顯改善，腦水腫程度明顯下降，說明唐梔子環烯醚萜苷可有效緩解腦出血疾病癥狀，其可能的機制在于調控凋亡基因并抑制細胞凋亡。

綜上，唐梔子環烯醚萜苷可通過下調Caspase-3、Bax蛋白并提升Bcl-2蛋白表達抑制細胞凋亡進程，從而對腦出血大鼠認知及運動功能起到保護作用。