活血散結中藥復方含藥血漿對bFGF干預下兔RPE細胞Bax、Bcl-2表達的影響

蔡婭仙，羅 萍，彭 俊，3，李建超，彭 抿，吳權龍，3*，彭清華

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.長沙縣星沙醫院，湖南 長沙 413200；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；4.西安市中醫醫院，陜西 西安 710000)

由生物學理論可知，成纖維細胞生長因子存在不同的異構體，由內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞分泌的bFGF就屬于其中之一，它可在動脈硬化灶中起到促進內皮細胞游走及平滑肌細胞增殖的作用。另外，bFGF可促進新血管形成，修復損害的內皮細胞[1]。視網膜色素上皮細胞無再生能力，細胞死亡后不是被替換，而是鄰近的細胞向側面滑動，以填補死亡細胞遺留下來的空間，視網膜色素上皮細胞增生可能會導致增生性玻璃體視網膜病變(PVR)[2-3]。彭清華教授結合多年臨床經驗，運用具有活血化瘀、軟堅散結功效之活血散結中藥復方治療PVR取得了較好療效，可顯著抑制增殖膜生長，改善眼部視力[4-7]，本研究通過體外細胞實驗，對活血散結中藥復方含藥血漿[8]對bFGF干預下兔RPE細胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達進行了探索，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇8只成年健康青紫藍兔，無性別限制，體質量1.5～2 kg，實驗動物提供方為上海市松江區動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(湘)2012-0008；選擇10只成年家兔，無性別限制，體質量1.5～2 kg，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(湘)2015-0004。所有實驗動物不進行特殊喂養，與日常相同，將實驗室內的溫度控制在18～26 ℃，實驗室內的空氣處于流通狀態，相對濕度應處于適宜含量，一般為55%左右。實驗前行常規眼底檢查(裂隙燈、間接眼底鏡)，排除眼內外疾患后方可進入實驗。實驗前所有動物適應性飼養1周。

1.1.2 藥品及試劑 活血散結中藥復方由三七6 g、丹參15 g、鱉甲15 g等藥品組成，飲片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供，所選藥材為同一批次，采用水煎法，分煎2次后混合藥液濃縮至1.025 g/mL生藥濃度，4 ℃下保存。bFGF(美國Sigma公司)；BGJ398(美國Selleck公司)；PBS緩沖液(湖南維世爾公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)。

1.1.3 實驗儀器 CO2細胞培養箱(美國Thermo公司 3111)；生物安全柜(美國Thermo公司 1300)；倒置顯微鏡(德國Motic公司 AE31)；低速離心機(美國Thermo公司 Fresco 17)；酶標儀(美國Bio-tek公司 ELX800)；電泳儀(北京六一儀器廠DYY-6C)；掃描儀(日本Canon9000F MarkⅡ)；成像系統(上海Tanon Tanon-5200)。

1.2 方法

1.2.1 兔視網膜色素上皮細胞培養與鑒定 首先將青紫藍兔處死，方法為耳緣靜脈處空氣栓塞法，可借助5 mL注射器，然后摘除眼球，須無菌操作，將角膜、晶狀體及玻璃體去除，用PBS沖洗，一般須進行3次，采用酶消化法獲取RPE原代細胞，將RPE細胞調整為(4～5)×104mL-1的密度，接種于25 mL培養瓶，在含5%CO2，濕度為90%的37 ℃培養箱中培養。當細胞貼壁鋪滿大部分瓶底即可進行傳代培養。在新的含5 mL完全培養基的培養瓶中分配細胞懸液，一般以1∶2～1∶5的比例進行分配，按照(4～5)×104mL-1的密度傳代培養。取對數生長期第2代細胞，采用Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 活血散結中藥復方含藥血漿制備 成年健康家兔10只，采用隨機數字表法分為A組空白組、B組活血散結中藥復方組，每組5只。根據人與家兔表面積換算方法計算(人以60 kg體質量為標準，家兔以1.6 kg體質量為標準)，活血散結中藥復方組臨床等效計量為5.064 g/(kg·d)。A組灌服蒸餾水，B組灌服活血散結中藥復方，每日20 mL/kg，每日2次，共5 d。采血前禁食禁水12 h，末次給藥2 h后，腹腔注射麻醉并將家兔固定后，取腹主動脈血于真空采血管內，顛倒混勻后靜置、離心，收集上清液。

1.2.3 含藥血漿對bFGF干預下兔RPE細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 實驗分為正常血漿組、bFGF組、bFGF+BGJ398組、bFGF+含藥血漿組，分別予以DMEM、正常血漿、bFGF(10μg·L-1)、bFGF(10 μg·L-1)+BGJ398(10 μg·L-1)、bFGF(10 μg·L-1)+活血散結中藥復方含藥血漿(10%)進行干預。根據不同分組的干預方式，加入相應干預因素，48 h后，收樣進行Western blot檢測，進行蛋白質定量后貯存于-80 ℃冰箱。制備PAGE膠，上樣、電泳、轉膜、膜封閉及抗體孵育后，行ECL化學發光檢測，將膠片進行掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對圖像進行灰度分析。

2 結果

Western blotting檢測結果表明，bFGF組與正常血漿組比較，Bax蛋白的顯影條帶明顯變淡，Bcl-2蛋白的顯影明顯增強，Bax/Bcl-2下調，差別均有顯著統計學意義(P<0.01)；bFGF+BGJ398組、bFGF+含藥血漿組與bFGF比較，Bax蛋白的顯影條帶明顯增強，Bcl-2蛋白的顯影明顯變淡，Bax/Bcl-2上調，差別均有顯著統計學意義(P<0.01)；bFGF+含藥血漿組與bFGF+BGJ398組比較，蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 蛋白表達

表1 含藥血漿對bFGF干預下RPE細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

3 討論

中醫學對于增生性玻璃體視網膜病變無明確記載，其病因病機尚有待深入研究，根據該病特點，大致將其歸類在“積聚”范疇，且隸屬于中醫眼科血證，具有眼科血證中出現的出血期、瘀血期、死血期、干血期的發展規律，又因PVR各階段癥狀的差別，也可將增生性玻璃體視網膜病變劃入“暴盲”及“視瞻昏渺”范圍。臨床研究表明，五臟六腑的功能失調、氣血瘀滯、外部損傷均可導致視衣失養，根據患者疾病表現分為不同證型，如氣血瘀滯型、痰濕內聚型等，至疾病后期，不同證型可出現相同的轉歸，可出現神膏衰損、痰結血瘀[8]。活血散結中藥復方的臨床功效為活血化瘀、軟堅散結，對于增生性玻璃體視網膜病變可起到增強視功能的作用。

研究[9]表明，與PVR相關的FGF為bFGF，bFGF是最早發現的可刺激成纖維細胞生長的因子，在PVR形成中起關鍵作用，本實驗用bFGF干預RPE細胞可有效模擬PVR體外模型。bFGF的功能通過位于細胞膜的酪氨酸激酶受體實現，酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)可有效抑制FGFRs活性[10]，其中，BGJ398(NVP-BGJ398)可高選擇競爭性抑制FGFR2，本實驗應用BGJ398作為活血散結中藥復方陽性對照組對照性良好。Bcl-2是一種抑制細胞凋亡蛋白，Bax是促進細胞凋亡蛋白[11]。細胞凋亡與凋亡蛋白、促凋亡蛋白之間的構成比例緊密相關，這對“分子開關”決定了細胞凋亡的易感性[12]。當Bax形成同二聚體時細胞凋亡作用為主導，當Bax與Bcl-2形成異二聚體時以抑制細胞凋亡為主導作用[13]。本實驗結果證明，bFGF對RPE細胞凋亡有顯著抑制作用，可抑制Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達。活血散結中藥復方含藥血漿可促進RPE細胞的凋亡，促進RPE細胞Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2比率上調，抑制Bcl-2蛋白表達，且與抑制劑作用相當。

本實驗采用體外培養RPE細胞增殖模型，成功建立了以RPE細胞增殖為首要因素的PVR體外細胞模型，通過Western blotting檢測可見，活血散結中藥復方促進PVR體外模型的RPE細胞凋亡可能是通過下調Bcl-2水平，上調Bax水平，抑制細胞分化，實現細胞凋亡，這可能是其治療增生性玻璃體視網膜病的機制之一。