復發性流產患者絨毛組織中血小板源性生長因子BB、誘導型一氧化氮合酶表達水平及與血管新生相關性

徐曉冬，高 云，曲冬穎

1.沈陽市第五人民醫院 婦產科，遼寧 沈陽 110023；2.北部戰區總醫院 婦產科，遼寧 沈陽 110016

復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指女性與同一性伴侶發生連續兩次或兩次以上的妊娠失敗[1]，是不孕癥中最重要的問題之一。RSA的發生可能由遺傳或子宮問題、血栓形成、自身免疫性內分泌疾病、感染等引起[2]，但有約50%的RSA患者的發病機制尚不明確[3]。血管生成是妊娠成功的關鍵，這一通路的中斷會導致各種不良妊娠結局，如RSA[4]。血小板源性生長因子BB(platelet derived growth factor BB，PDGF-BB)可通過調控血管內皮生長因子誘導的內皮細胞增殖來調節血管生成[5-6]，在RSA中發揮重要作用。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是調節血管生成的重要因子[7]，在正常妊娠中，iNOS參與排卵、著床、滋養細胞入侵、胚胎發育等[8]。有研究報道，iNOS因在血管生成中的作用而可能影響RSA[9]。本研究旨在探討RSA患者絨毛組織中PDGF-BB、iNOS的表達水平及其與血管新生的相關性?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將沈陽市第五人民醫院自2014年1月至2019年1月收治的200例RSA患者納入B組。納入標準：年齡20～40歲；超過2次自然流產史；夫妻雙方無染色體異常。排除標準：合并相關內科疾病。另將同期收治的200例行人工流產的正常早孕患者納入A組。A組平均年齡(32.16±2.21)歲，平均孕周(10.65±1.67)周；B組平均年齡(32.87±2.56)歲，平均孕周(10.23±1.25)周。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺１狙芯拷涐t院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 鼠抗人PDGF-BB單克隆抗體(北京鼎國生物技術公司)，兔抗iNOS多克隆抗體、兔抗CD105多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體(美國Abcam公司)，裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術公司)，蛋白Marker、二抗(武漢博士得公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 Western Blot 將絨毛組織裝入EP管，稱重，置于冰上剪碎。按比例加入裂解液、蛋白酶抑制劑，混勻，超聲細胞粉碎儀(JY-882N，寧波新藝生物公司)將管內組織打碎，置于4℃裂解30 min后，12 000 r/min、4℃離心30 min，保留上清液。根據BCA蛋白試劑盒說明書進行具體操作，100℃煮制蛋白5 min使蛋白變性，分裝儲存于-80℃備用。配制分離膠和濃縮膠，在配制膠的兩端加入蛋白Maker作為標記，其余空白孔道中加入樣品，根據測定的蛋白濃度等質量上樣，電泳、跑膠、轉膜。清洗后將膜用5% BSA封閉后置于37℃溫箱中1 h，再分別加入iNOS一抗(1∶2 000)、PDGF-BB一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶5 000)，4℃孵育過夜。復溫后加入HRP標記的二抗(1∶5 000)，置于37℃溫箱中孵育2 h。PVDF洗膜液中將膜清洗10 min，共3次。采用Bio-Rad Lab軟件進行ECL發光，拍攝照片進行保存。通過灰度分析計算PDGF-BB、iNOS與對照GAPDH的比值。

1.3.2 免疫組化 4%甲醛溶液固定絨毛組織36 h，石蠟包埋、切片，采用S-P免疫組化兩步法，DAB顯色、脫水、透明和封片。然后對絨毛膜組織中的PDGF-BB、iNOS表達進行分析；CD105標記新生血管內皮，觀察PDGF-BB、iNOS與微血管密度(microvessel density，MVD)的相關性。10×40倍顯微鏡下觀察PDGF-BB、iNOS的表達，評分參照Fromowitz綜合計分法[10]，除外陰性均視為陽性，陽性率計算方法參考文獻[11]；MVD計數方法參考文獻[12]。

2 結果

2.1 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB和iNOS蛋白表達水平比較 與A組比較，B組絨毛組織中PDGF-BB蛋白表達減少，iNOS蛋白表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB和iNOS蛋白表達水平比較

2.2 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB蛋白免疫組化染色結果比較 B組絨毛組織中PDGF-BB蛋白陽性率低于A組(34.0%比60.5%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB蛋白免疫組化染色結果(a.A組；b.B組；400倍)

2.3 兩組患者絨毛組織中iNOS蛋白免疫組化染色結果比較 B組絨毛組織中iNOS蛋白陽性率高于A組(59.0%比36.0%)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組患者絨毛組織中iNOS蛋白免疫組化染色結果(a.A組；b.B組；400倍)

2.4 兩組患者絨毛組織中MVD比較 B組平均MVD低于A組[(25.77±4.98)比(39.68±5.39)]，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 PDGF-BB、iNOS與MVD相關性 A組、B組PDGF-BB與iNOS表達水平呈負相關(r=-0.689、-0.815，P<0.05)，PDGF-BB與MVD呈正相關(r=0.758、0.826，P<0.05)，iNOS與MVD呈負相關(r=-0.793、-0.861，P<0.05)。

3 討論

在維持正常妊娠過程中，充足的新生血管是必不可少的[13]。因此，血管調控因子在妊娠期發揮著至關重要的作用。PDGF-BB是一種促進血管生成的生長因子，可以刺激內皮細胞形成新生的血管網絡，穩定血管發育。PDGF-BB存在于子宮內膜的管腔上皮、子宮間質、子宮腺體和子宮內膜的血管，其表達下降會導致小鼠周細胞數量減少、滋養細胞減少、血管明顯擴張、水腫，甚至胚胎死亡。PDGF-BB及其血管生成受體參與組織重構，并作為炎癥反應的傳播者和效應器發揮作用。PDGF-BB還是調控胚胎著床部位的子宮內膜間質細胞運動因子之一[14]。在有氧環境中，iNOS被誘導表達，產生過量的一氧化氮與超氧化物發生反應，導致過氧亞硝酸鹽的形成，并產生細胞毒性。在病理條件下生成的一氧化氮能夠減少輸卵管運動，引起子宮肌纖維收縮，從而導致流產[15]。有研究報道，PDGF-BB能夠通過誘導ERK1/2激活而抑制iNOS表達[16]。

MVD是衡量血管生成的定量指標。CD105作為標記血管新生的特異性標志物，明顯區別于泛血管內皮細胞標志物的特征是其僅在增殖活躍的血管內皮細胞上呈強表達。有研究報道，在妊娠早期胚胎發育和胎盤處于相對缺氧的環境中時，缺氧誘導因子-lα被激活，并誘導下游靶基因PDGF-BB轉錄和翻譯，從而參與胎盤滋養細胞浸潤和絨毛血管發育；而在稽留流產的絨毛組織中，PDGF-BB表達降低，導致絨毛血管結構發育不良、血管生成受阻、血管數目減少和形態異常、血管滲透性增加，使胎兒胎盤單位灌注不足，胚胎缺血缺氧，從而導致流產[11，17]。Nanaev等[18]研究表明，在妊娠豚鼠胎盤血管附近的滋養細胞中有iNOS表達，該細胞可以破壞血管壁，導致血管生成減少，進而引起不良妊娠，導致流產。

綜上所述，RSA患者絨毛組織中PDGF-BB和iNOS的異常表達使胎盤血管新生受限，影響胚胎發育，導致流產。