戰傷后污染精子收集及純化方法

崔 鑫，張 寧，陸 輝，于月新

北部戰區總醫院 生殖醫學中心，遼寧 沈陽 110016

戰時男性泌尿生殖系統傷害發生率高[1-2]，骨盆個人防護裝備、護腹股溝合成內衣、凱夫拉板等防護裝備可對泌尿生殖系統起到一定的保護作用[3]。當睪丸受到破壞性損傷時，立即從精囊或殘余輸精管中收集搶救精子并進行冷凍保存，復蘇后用于體外受精胚胎移植，可使受傷官兵獲得自己的后代[4-5]。本研究旨在探索戰時泌尿生殖系統損傷后污染精子的收集及純化方法。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2019年1月1日—5月1日于北部戰區總醫院生殖醫學中心門診就診的500例男性志愿者為研究對象。納入標準：禁欲2～7 d，手淫取精后精液體積≥3 ml。研究對象平均年齡(25±5)歲。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 1.6%感染率污染模型制備 收集志愿者精液，隨機每10份為1組。選取自然環境中土壤、砂子、樹葉、污水、血液、灰塵，分別選取采樣點5處，將精液與上述污染物混合備用(污染精子原液)。前期建立1.6%感染率污染模型(200例志愿者)，從0.1%慶大霉素加入精子洗液起始，根據除菌效果，逐漸升高加入的慶大霉素濃度，找到除菌效率高的加入下限后停止濃度摸索。將精液標本隨機分為兩組，密度梯度法組和上游法組。

1.2.2 除雜質沉淀污染精子中大量固體雜質 吸取污染精子500 μl于2 ml離心管中，將含慶大霉素的精子洗液1 000 μl緩慢加于污染精子上層，避免吹起精液層，37℃恒溫箱上游30 min。

1.2.3 密度梯度法 進一步除雜質及死精子。將經過1.2.2除雜質后的上清液300 μl緩慢加入50/90密度梯度液上層，800 r/min離心15 min，吸取沉淀，計數精子密度及活力并涂板，血平板、巧克力平板37℃恒溫箱培養48 h。

1.2.4 上游法 進一步除雜質及篩選出活力高的精子。吸取經密度梯度法處理后的精液沉淀，再次按照1.2.2除雜質后，吸取上清、精液層計數精子密度及活力并涂板，血平板、巧克力平板37℃恒溫箱培養48 h。

1.2.5 2.0%感染率污染模型制備 1.6%感染率污染模型達到預期實驗效果后建立2.0%感染率污染模型(300例志愿者)，從1.6%感染率污染模型加入慶大霉素下限起始，根據除菌效果，逐漸升高加入的慶大霉素濃度，找到除菌效率高的加入下限后停止。后續操作同1.2.2、1.2.3、1.2.4。

1.3 計數方法 吸取10 μl精子滴于精子計數板上，蓋上計數板蓋，顯微鏡下計數精子密度及精子活力(前向運動精子率、非前向運動精子率)。每份樣本計數2次，取平均值。

密度回收率=處理后精子密度/處理前精子密度×100%

活力提高率=[處理后(前向運動精子率+非前向運動精子率)-處理前(前向運動精子率+非前向運動精子率)]/處理前(前向運動精子率+非前向運動精子率)×100%

2 結果

2.1 1.6%感染率污染模型除菌及精子回收結果 污染精子原液：精子密度為95.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(34.00%+10.00%)。除雜質后：血平板、巧克力平板均有菌落生長，但菌落數與污染精子原液涂板比較，有明顯減少趨勢；上清液中，精子密度為22.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(73.00%+18.00%)，密度回收率為23.16%，活力提高率為107.00%。密度梯度法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；沉淀中，精子密度為13.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(61.00%+22.00%)，密度回收率為13.68%，活力提高率為88.64%。上游法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；上清液中，精子密度為0.11×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(65.00%+11.00%)，密度回收率為0.12%，活力提高率為72.73%；沉淀中，精子密度為48.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(43.00%+8.00%)，密度回收率為50.53%，活力提高率為15.91%。因單純除雜質無法抑制細菌生長，僅對密度梯度法和上游法對精子的回收情況進行比較：密度梯度法處理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法處理后上清液，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 2.0%感染率污染模型除菌及精子回收結果 污染精子原液：精子密度為96.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(38.00%+11.00%)。除雜質后：血平板、巧克力平板均有菌落生長，但菌落數與污染精子原液涂板比較，有明顯減少趨勢；上清液中，精子密度為21.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(50.00%+3.00%)，密度回收率為21.88%，活力提高率為8.16%。密度梯度法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；沉淀中，精子密度為17.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(45.00%+5.00%)，密度回收率為17.71%，活力提高率為2.04%。上游法處理后：血平板、巧克力平板均無菌落生長；上清液中，精子密度為0.09×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(43.00%+3.00%)，密度回收率為0.09%，活力提高率為-6.12%；沉淀中，精子密度為71.00×106個/ml，前向運動精子率+非前向運動精子率為(43.00%+1.00%)，密度回收率為73.95%，活力提高率為-10.20%。因單純除雜質無法抑制細菌生長，僅對密度梯度法和上游法對精子的回收情況進行比較：密度梯度法處理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法處理后上清液，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

利用精子庫和生殖保障車為戰時男性泌尿生殖系統損傷傷員提供緊急救治，根據傷情程度采用不同方法采集并凍存精子，可為保存男性傷員生育力提供有效保障。同時，應對傷員進行心理干預，通過生育指導、輔助生殖助孕、產前診斷、隨訪等一系列優生優育措施，為軍人提供生育保障，提高部隊官兵戰斗力。

目前，精子的洗滌方法主要有直接上游法、非連續密度梯度法等。Waldemar等[6]采用三次精子洗滌、病毒RNA純化及定量聚合酶鏈式反應純化人類免疫缺陷病毒感染者的精子以實施夫精人工授精干預。Andrea等[7]采用精子洗滌方法對人乳頭狀瘤病毒感染者進行輔助生殖技術前的精子純化。本研究結果提示，密度梯度離心可有效去除污染精子中的污物，并保存良好的精子密度及精子活力以供輔助生殖助孕。但由于添加了抗生素，在后續的臨床使用過程中，需考慮體外受精使用者對抗生素的過敏情況。本實驗的技術難點在于從傷殘的睪丸組織和殘余的精囊或輸精管中獲取精子后，立即應用基層現有設備對污染精液進行污染的快速消除。本實驗對抗生素種類、抗生素添加比例、密度梯度離心液種類、離心時間、上游時間等過程做了梯度認證，實驗結果報告了抗菌成功及保證精子密度、活力的步驟，數據可為其他實驗室提供參考。

綜上所述，慶大霉素、密度梯度離心、上游等聯合分離純化污染精子可消除細菌生長，使精子具備行輔助生殖技術的密度和活力。