非諾貝特通過介導TGF-β1/Smad3信號通路對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用研究

阮華玲，郭昆全，楊 坤，葉林秀，閻勁松，周麗榮

隨著人們生活方式及飲食習慣的改變，糖尿病發生率逐年升高[1]。糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性并發癥中較為常見的一種，早期表現為腎臟肥大、腎小球基底膜增厚并伴隨以腎小球系膜區為主的細胞外基質(ECM)積聚，隨著病情惡化會進一步發展為腎小球硬化及腎小管間質纖維化，引起腎衰竭[2-3]。目前DN的發生機制尚不清楚，但脂代謝異常作為DN發生、發展的主要影響因素，逐漸成為研究的熱點[4]。非諾貝特作為過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)的特異性激動劑，是一種以降低三酰甘油(TG)為主療效的降血脂藥物[5]。既往研究表明，非諾貝特對于DN模型大鼠的腎功能具有一定保護作用[6]，但具體機制尚不清楚。近年研究發現，轉化生長因子-β1(TGF-β1)是DN發病的核心因子，能夠與多種信號通路作用，來調控DN纖維化進程[7]，其中TGF-β1/Smads信號通路在誘導ECM產生的過程中發揮著重要作用[8]。本研究通過高糖高脂飼料飼養聯合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射構建DN大鼠模型，利用非諾貝特干預探討其保護DN大鼠腎功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只4周齡SD大鼠，雌雄各半，體質量200～220 g，購于廣東省南方醫科大學，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2016-0041，SPF級飼養環境常規飼養，全天自由飲水。

1.2主要試劑 STZ、非諾貝特購自美國Sigma-Aldrich公司；高糖高脂飼料購自遼寧長生生物技術有限公司；兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad7、β-actin抗體購自美國Abcam公司。

1.3動物模型制備、干預及分組 將30只大鼠分為正常對照組、模型組和非諾貝特組，適應性飼養1周后，正常對照組大鼠給予常規飼料飼養，模型組和非諾貝特組大鼠給予高糖高脂飼料飼養。飼養5周后，模型組和非諾貝特組大鼠單側腹腔注射30 mg/kg STZ構建糖尿病模型[9]；72 h后檢測空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L視為造模成功，繼續飼養2周，檢測尿量及24 h尿蛋白定量高于造模前2倍即為DN造模成功。非諾貝特組大鼠給予50 mg/kg非諾貝特腹腔注射，正常對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。連續干預8周，實驗期間每周檢測1次FBG、每2周檢測1次24 h尿蛋白定量。

1.4樣本采集及處理 末次給藥后，留取24 h尿標本，離心后取上清保存；測量各組大鼠體質量，10%水合氯醛麻醉后，取心臟血，離心后取上清保存；利用生理鹽水灌注后迅速取出腎臟，剝離包膜稱取腎重，并計算腎臟指數(KI)，KI=腎質量/體質量×1000；取部分腎皮質，用4%多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋切片，剩余腎組織液氮冰凍后于-80℃環境中保存待測。

1.5生化指標檢測 取“1.4”中留取的尿標本和血清標本，利用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白定量，應用DCX800型全自動生化分析儀(美國BECKMAN公司)檢測血尿肌酐水平，并計算肌酐清除率(Ccr)，Ccr=[尿肌酐×尿液體積/血肌酐]×[1/1440][9]；應用DCX800型全自動生化分析儀檢測血清樣本中TG、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.6HE和Masson染色觀察腎組織病理特點及纖維化程度 取“1.4”中制備好的切片，常規脫蠟脫水后行HE染色，Olympus光學顯微鏡觀察腎組織形態結構，并在每個組織上隨機選取至少10個視野，利用Image-pro plus軟件計算腎小球面積(GA)；另取石蠟切片脫蠟后行Masson染色，肌纖維呈紅色、膠纖維呈藍色，藍色面積越大表示腎組織纖維化程度越嚴重。

1.7Western blot法檢測腎組織蛋白表達 取“1.4”中凍存的腎組織，液氮中研磨成粉，加入組織裂解液后提取組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，待溴酚藍快到膠底部時停止轉膜，4℃下用5%的脫脂奶粉封閉處理2 h，加入α-SMA(1︰500)、PAI-1(1︰500)、TIMP-1(1︰500)、TGF-β1(1︰1000)、Smad3(1︰1000)、p-Smad3(1︰1000)、Smad7(1︰1000)、β-actin(1︰1000)孵育過夜；洗膜，加入二抗(1︰200)在37℃條件下恒溫孵育1 h后，TBST漂洗40 min，使用ECL試劑盒在DNR BioImaging System上觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用Image J軟件測定各組條帶灰度值。

2 結果

2.1各組大鼠腎組織病理及纖維化程度 HE染色結果顯示，正常對照組大鼠腎小球結構清晰，形態正常，無異常病理改變；模型組大鼠可見腎組織間質大量炎性細胞浸潤，腎小管狹窄、萎縮，近曲小管上皮細胞壞死，腎小管擴張，可見管型；非諾貝特組大鼠較模型組大鼠病變程度減輕，近曲小管好似較少，腎小管結構恢復較好，炎性細胞浸潤明顯減少。Masson染色結果顯示，正常對照組大鼠無明顯纖維化改變；模型組大鼠腎組織纖維化程度較為嚴重，出現腎小球硬化、腎間質纖維化改變；非諾貝特組大鼠較模型組大鼠腎組織纖維化程度減輕。見圖1。模型組和非諾貝特組大鼠KI、GA、纖維化程度均明顯高于正常對照組大鼠，非諾貝特組大鼠KI、GA、纖維化程度顯著低于模型組大鼠，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠KI、GA、纖維化程度比較

圖1 各組大鼠腎組織病理改變及纖維化程度觀察(×400)

2.2各組大鼠血尿生化指標比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量、TG、TC、LDL-C顯著高于正常對照組，Ccr、HDL-C水平低于正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，非諾貝特組大鼠24 h尿蛋白定量、TG、TC、LDL-C均顯著降低，Ccr、HDL-C水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血尿生化指標比較

2.3各組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達水平比較 與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，非諾貝特組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、

圖2 各組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達圖譜 α-SMA為α-平滑肌肌動蛋白，PAI-1為纖溶酶原激活物抑制劑-1，TIMP-1為金屬蛋白酶組織抑制劑-1

2.4各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達水平比較 與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達水平顯著升高，Smad7蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組大鼠相比，非諾貝特組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達水平顯著降低，Smad7蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達圖譜 TGF-β1為轉化生長因子-β1

表4 各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達水平比較

3 討論

DN為一種糖尿病慢性并發癥，終末期腎衰竭是引起糖尿病患者死亡的主要原因。隨著糖尿病發生率逐年升高，DN的發生率也逐年升高。蛋白尿是DN患者主要的臨床特征，而尿蛋白排泄量的增加提示患者腎功能受損，也是目前臨床上診斷DN最主要的生化指標[10]。本研究利用高糖高脂飼料飼養聯合STZ腹腔注射制備糖尿病大鼠模型[11]，造模后通過檢測24 h尿蛋白定量增加情況來構建DN模型。研究表明，富含小顆粒的TG及致密LDL氧化、糖化后的脂蛋白具有細胞毒性，通過激活體內TGF-β1的釋放，既能激活炎癥反應，引起腎組織炎性浸潤，又能促進ECM的生成，引起腎臟肥大及ECM進行性積累，造成腎小球硬化[12]。PPAR-α是由配體激活的一類核轉錄因子，在肝臟中廣泛表達，參與脂肪調控過程。非諾貝特是一種PPAR-α激動劑，主要通過激活PPAR-α從而發揮降脂作用[13-16]。除了具有降脂作用外，非諾貝特還具有抗氧化、抗癌、抗炎及抗凋亡等多種生物學活性[17-18]。本研究發現大鼠腎小球結構損傷明顯改善，且24 h尿蛋白定量顯著降低，Ccr明顯升高，可能是因為非諾貝特發揮降脂作用，降低了TG、LDL-C水平，減少了損傷細胞的脂蛋白生成，同時還能發揮抗炎作用減輕腎組織中炎性浸潤，從而減輕了對腎組織細胞的損傷。

腎小球硬化及腎間質纖維化是DN腎衰竭主要的病理改變。高血糖、炎癥反應、氧化應激等因素均是DN患者腎纖維化的危險因素。ECM的過量積累是引起腎纖維化的主要原因，而腎小管中的ECM主要由成纖維細胞合成，α-SMA是肌成纖維細胞的主要靶標蛋白，其表達水平升高提示ECM分泌功能增強[19]。PAI-1和TIMP-1受TGF-β1信號調控，前者通過抑制纖溶酶原激活物激活減少膠原及糖蛋白的降解[20]，而后者則是基質金屬蛋白酶(MMPs)的主要抑制劑，能夠通過降低MMPs的合成來減少ECM的降解[21]，二者表達增強會促進纖維化的進展。本研究結果顯示，模型組大鼠腎組織中α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達顯著升高，非諾貝特干預后α-SMA、PAI-1、TIMP-1蛋白表達水平顯著降低，表明非諾貝特能夠抑制ECM的大量生成，從而減緩腎纖維化進程。TGF-β1/Smad3作為調控腎纖維化的主要信號通路，DN發生后誘導TGF-β1合成增加，TGF-β1高表達后與其Ⅱ型受體在胞外結合并使Ⅰ型受體磷酸化，激活下游的Smad2/Smad3，并與Smad4結合后進入細胞核內，從而誘導PAI-1和TIMP-1等相關轉錄因子表達升高[22]。Smad7作為一種抑制因子，能夠與TGF-β1受體結合，抑制Smad2/Smad3轉錄[23]。本研究結果顯示，DN模型大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達水平顯著升高，而Smad7蛋白表達水平顯著降低，非諾貝特干預后大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表達水平顯著降低，而Smad7蛋白表達水平顯著升高，表明非諾貝特能夠通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路，降低促纖維化因子表達，從而緩解DN大鼠腎纖維化損傷。

綜上，非諾貝特可能通過降低DN大鼠血脂抑制TGF-β1/Smad3信號通路激活，降低促纖維化相關蛋白表達，改善腎纖維化進程，從而保護腎功能。