幾種外源物質對鹽脅迫下火力楠幼苗生理特性的影響1)

粟莉圓 胡穎 梁機 楊章旗 陳旋 孫明升

(廣西大學，南寧，530004)(廣西壯族自治區林業科學研究院)

鹽脅迫不僅會導致植物滲透脅迫，根系吸水困難，造成水分及營養的供應不足；同時體內積累活性氧，若不能及時清除會對葉綠素、不飽和脂、蛋白質、核酸等生物分子具有破壞作用[1]，進而引起酶活性下降、蛋白降解和脂質過氧化等反應[2]。甜菜堿(BT)具有調節植物對環境脅迫的適應性，提高細胞滲透調節的能力，可減少滲透失水對植物造成的傷害[3]。它具有保持細胞與外界環境滲透平衡的穩定復合蛋白4級結構，使受到鹽脅迫影響而降低的Rubisco恢復活力，保持相關酶處于有功能的狀態[4]；有研究表明在鹽脅迫下添加外源甜菜堿后，明顯提高了玉米及小麥的光合能力、氣孔導度、蒸騰速率和相關抗氧化酶的活性，從而抵御鹽脅迫環境[5]。鈣(Ca2+)是植物生長發育所必須的元素，與維持細胞膜通透性、離子運輸、信號轉導等過程息息相關[6]，可增加植物抗性，尤其是產生抗鹽性狀。鹽脅迫下，細胞游離Ca2+濃度的增加顯著減少了細胞內Na+的濃度。有證據表明，Ca2+是通過降低質膜透性來減少Na+進入細胞的。當植物受到鹽脅迫時，細胞內的Ca2+濃度增加，Ca2+通過與其主要受體CaM結合，從而進一步激活適當的蛋白激酶，激發細胞產生應激反應，這是Ca2+的一般作用方式[4]。丁能飛等[7]發現外源鈣的添加可顯著促進西蘭花的生長、增加鮮重，使SOD、POD、CAT活性升高，降低西蘭花葉片MDA含量，減輕鹽脅迫對葉片膜脂過氧化程度，減少地上部、地下部Na+的積累，增加K+、Ca2+的濃度，提高其耐鹽性。茉莉酸(MeJA)參與調控植物發育、滲透脅迫和防御反應過程等[8]。有研究表明外源施用茉莉酸甲酯能有效對抗鹽脅迫造成的生長抑制，減輕鹽脅迫對幼苗造成的傷害，提高幼苗的耐鹽能力[9]。研究還發現，MeJA不僅可系統誘導蛋白酶抑制劑(PI)和多酚氧化酶(PPO)，從而影響植物對營養物質的吸收，還能增加過氧化物酶和脂氧合酶等防御蛋白的活性水平，使植物積累生物堿和酚酸類次生物質增加并改變揮發性信號化合物的釋放[10]。Taheri et al.[11]報道了鹽脅迫誘導牛舌草葉片鮮質量、葉面積、葉相對含水量(RWC)、葉綠素a、可溶性糖、總蛋白質等含量顯著降低，而MeJA緩解了鹽脅迫植株的不良作用。水楊酸(SA)對植物的作用主要在防病害及緩解逆境脅迫方面，作為信號分子來調控植物基因表達而影響其生理特性，提高植物抗性[12]。在Mimouni et al.[13]的研究中，NaCl脅迫下大針茅幼苗的相對電導率和MDA質量分數提高，而凈光合作用、相對含水量降低，幼苗整體的生長速率明顯降低。對葉片施用SA能提高葉綠素質量分數和抗氧化酶活性，并增加CO2的凈同化速率，提高光合作用過程，減輕膜損傷，進而增加了莖和根的干物質含量。還有研究發現幼苗的發芽率和生長速率(從莖和根的長度來看)在鹽處理下顯著降低，通過添加SA可以調節緩解鹽脅迫對水稻植株的不利影響[14]；外施不同濃度的水楊酸后，白刺葉片質膜所受傷害均有不同程度的緩解[15]。目前，國內外對植物耐鹽生理機制、外源物質添加對植物生理的影響做了許多研究，外源添加上述4類物質已被證明可有效緩解鹽脅迫對植物的傷害；但同時使用兩種以上外源物質及其不同濃度處理探究植物鹽脅迫生理特性的報道較少，此外研究對象多為農作物等草本植物，在用材林樹種火力楠耐鹽性方面也未涉及。

廣西濱海地區土壤作為后備資源用地，具有優良的立地條件，但造林樹種單一，生物多樣性低[16]，豐富沿海造林樹種，對廣西林業發展以及生態可持續具有重要的意義。但沿海地區土壤含鹽量高，過量的鹽會影響植物種子萌發、生長發育和光合作用，最終對植物產生毒害作用。火力楠(MicheliamacclureiDandy)學名醉香含笑，為木蘭科含笑屬喬木，是華南地區珍貴速生常綠闊葉樹種之一，具有很高的經濟價值。其木材可做優良建筑和家具用材，果實可提取植物油。本文研究4種外源物質對鹽脅迫下火力楠幼苗生理指標的影響，探究外源物質處理對鹽脅迫下火力楠幼苗的生理代謝機制，篩選出緩解鹽脅迫的最佳外源物質種類及其濃度或物質的量，旨在為廣西沿海造林綠化與生態工程建設提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗苗木處理在廣西大學林學院苗圃進行，供試1年生火力楠幼苗來源于廣西林科院。2018年7月選取長勢一致、健康良好，苗高55～65 cm的1年生火力楠盆栽幼苗用于試驗。

1.2 試驗設計

鹽脅迫前對幼苗采用BT、CaCl2、MeJA、SA 4種外源物質進行噴施處理，每種外源物質分別設置低、中、高3種質量濃度或濃度梯度(表1)。一個組包含30～40株幼苗，總共12組，另設對照。每天上午08：00對火力楠幼苗噴施上述溶液，噴施量以葉片正反面完全濕潤到剛有水滴出為準，連續噴施3 d，而后使用300 mmol·L-1NaCl溶液浸沒至營養杯2/3處，處理7 d。以未作任何處理的普通幼苗為對照CK1，以單鹽脅迫處理幼苗為對照CK2，分別在NaCl處理第1天、第4天和第7天早上08：00測定葉綠素質量分數，并采集幼苗根莖向上第4～5位火力楠葉片帶回實驗室保存在超低溫冰箱-80 ℃，進行其余各項指標測定，重復3次。

表1 不同處理組合梯度設置

1.3 指標測定

采用相對電導率法[17]測量細胞膜透性；葉綠素質量分數采用SPAD502葉綠素含量測定儀測定。可溶性糖質量分數(SS)、可溶性蛋白質量分數(SP)、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性分別根據蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒說明書進行測定。

1.4 數據分析

試驗數據用Excel 2010進行收集與整理，檢驗方法使用雙因素重復測量方差分析，運用SPSS 24進行一般描述與統計并進行事后多重比較(LSD法)，P<0.05為顯著差異，Oringin 2017作圖；Fuzzy綜合評價法評價不同處理下火力楠幼苗的耐鹽性，具體計算方法如下：

2 結果與分析

2.1 外源物質處理對鹽脅迫下葉片相對電導率的影響

由表2可知，隨著鹽脅迫時間的增加各處理的相對電導率逐漸升高，CK2處理葉片在NaCl脅迫后的相對電導率均顯著高于CK1(P<0.05)，說明葉片細胞膜受損，膜透性逐漸增大。噴施外源物質后，各處理的相對電導率均顯著低于單鹽脅迫CK2，4種外源物質的中等質量濃度或濃度處理下相對電導率較低，其中S2、C2、MJ2處理的相對電導率分別為CK2的71.93%、73.68%、75.44%。以上分析表明這4種外源物質中等質量濃度或濃度處理可顯著緩解葉片鹽害，其中SA中質量濃度處理(S2，100 mg·L-1SA)相對電導率最小，緩解鹽傷害效果最好。

表2 鹽脅迫下外源物質處理葉片相對電導率的變化

2.2 外源物質處理對鹽脅迫下葉片葉綠素質量分數的影響

從表3可以看出，隨著鹽脅迫時間的增加，各處理葉綠素質量分數呈下降趨勢。脅迫7 d后，大部分處理葉綠素的質量分數均高于對照CK2，但差異均未達到顯著水平，比CK2高出0.02～0.21 mg·g-1。由此可見，火力楠幼苗葉綠素質量分數在短時間鹽脅迫下響應不靈敏，在外源物質作用下略有提高。

表3 鹽脅迫下外源物質處理火力楠幼苗葉綠素質量分數變化

2.3 外源物質處理對鹽脅迫下葉片可溶性蛋白和可溶性糖的影響

表4顯示，隨著鹽脅迫時間的增加，單鹽處理CK2的可溶性糖質量分數逐漸升高，在7 d后為CK1的1.21倍，在4種外源物質作用下可溶性糖質量分數較CK2均有提高，且存在顯著差異(P<0.05)。4種外源物質處理調節可溶性糖質量分數升高作用大小排序為MeJA、BT、SA、CaCl2；外源物質MeJA高物質的量、BT高濃度以及CaCl2低物質的量處理下可溶性糖質量分數顯著高于CK2，其中可溶性糖質量分數最高的MJ3(3 mmol·L-1)比CK2高出2.28 mg·g-1。

表4 鹽脅迫下外源物質處理葉片可溶性糖質量分數變化

從表5可以看出，噴施不同4種外源物質在鹽脅迫后可溶性蛋白質量分數均高于CK2(P<0.05)，且由大到小MeJA、SA、BT、CaCl2。其中MeJA、BT處理與CK2存在顯著差異；但其不同濃度或物質的量處理間不存在明顯差異。測定結果表明，鹽脅迫下火力楠幼苗滲透調節功能受到了影響，4類外源物質均可調節火力楠幼苗的滲透能力，減輕幼苗受到的傷害，綜合比較發現外源MeJA處理可顯著調節葉片中可溶性糖和蛋白質的質量分數，其次SA、BT處理效果也相對較好。

表5 鹽脅迫下外源物質處理葉片可溶性蛋白質量分數的變化

2.4 外源物質處理對鹽脅迫下葉片CAT、POD、SOD活性的影響

由表6可知，在整個鹽脅迫過程中CK2活性都高于CK1，在4d后達到顯著差異(P<0.05),說明鹽脅迫刺激火力楠幼苗CAT活性升高；不同外源物質處理后，除B1、C2外各處理CAT活性總體呈升高趨勢。MeJA作用相比其他3種外源物質使幼苗CAT活性升高更明顯，MeJA高物質的量處理(MJ3)后葉片CAT活性為CK2的1.51倍。

表6 鹽脅迫下外源物質處理葉片CAT活性變化

鹽脅迫后，CK2的POD活性先升高后下降，四種外源物質均能提高葉片POD活性(表7，P<0.05)，作用大小排序為MeJA、CaCl2、SA、BT，其中MeJA、CaCl2這兩種外源物質與對照存在明顯差異；4種外源物質的低質量濃度或濃度處理后葉片POD活性均顯著高于對照。POD活性最高為S1(25 mg·L-1SA)處理后的火力楠葉片，最低為S3(200 mg·L-1SA)處理，說明POD活對SA濃度變化響應靈敏。

表7 鹽脅迫下外源物質處理葉片POD活性變化

從表8可以看出，整個鹽脅迫過程中單鹽處理(CK2)的SOD活性均高于CK1，隨著脅迫時間的增加呈升高趨勢，4種外源物質處理后SOD活性均顯著提高(P<0.05)；外源物質CaCl2低、中濃度以及SA中、高質量濃度作用相較其他處理的SOD活性升高顯著。綜上可得，除MJ2外，各處理均能顯著增加火力楠幼苗葉片中的SOD活性，其中S2(100 mg·L-1SA)處理下葉片SOD活性升高明顯。

2.5 鹽脅迫下火力楠幼苗生理指標的相關分析

由表9可得，鹽脅迫下火力楠葉片相對電導率(RC)與可溶性糖質量分數、SOD活性呈極顯著正相關(P<0.01)；葉綠素質量分數與可溶性糖質量分數呈顯著負相關(P<0.05)；可溶性蛋白質量分數與CAT活性呈顯著正相關(P<0.05)，與SOD活性呈極顯著正相關(P<0.01)。相關分析結果表明當幼苗受到鹽脅迫導致葉片受到傷害，細胞液外滲、相對電導率升高，活性氧等氧化物自由基對細胞膜系統的損害加重，細胞內滲透調節物質如可溶性糖、可溶性蛋白質量分數及CAT、SOD酶活性也升高，而葉綠素質量分數受到鹽脅迫影響而降低。

表9 鹽脅迫下火力楠幼苗各生理指標間的相關分析

2.6 外源物質處理下火力楠幼苗耐鹽脅迫的綜合評價

采用Fuzzy綜合評價法計算各處理指標的隸屬值及對總分排序(表10)，總分越高表示參試處理越能降低火力楠幼苗所受鹽害。4類外源物質緩解效果排序由大到小為MeJA、SA、CaCl2、BT，其不同質量濃度或濃度處理排序由大到小分別為B1、B3、B2，C1、C3、C2，MJ3、MJ1、MJ2，S2、S3、S1。排名大于CK1的處理從高到低為MJ3、S2、C1、MJ1、S3、MJ2、S1、C3、B1、B3、C2。說明對葉片噴施3 mmol·L-1MeJA(MJ3)最能有效提高火力楠幼苗的耐鹽能力。

表10 鹽脅迫下外源物質處理火力楠幼苗生理指標的隸屬值及排序

3 結論與討論

對多數植物來講，鹽含量過高會影響植物生長發育和生理功能，改變植物體內的滲透平衡，降低光合作用，使植物生長變慢甚至死亡[18]。研究表明，逆境脅迫下細胞膜相對透性明顯變化，大量細胞內物質外滲，組織浸泡液的電導率會升高，同時還引起生理代謝紊亂，酶系統受影響，葉綠體結構遭破壞，光合作用變弱等[19]。本研究在300 mmol·L-1NaCl脅迫下，火力楠幼苗的相對電導率隨著脅迫時間的增加顯著升高，與前人研究結果相一致[18]。噴施中等質量濃度或濃度的BT、CaCl2、MeJA、SA后的火力楠幼苗均可提高其耐鹽能力，其中100 mg·L-1SA處理效果好。可能由于在脅迫中SA是驅動植物防御基因的表達的信號因子，能誘導特異基因表達，合成與植物細胞防御有關的蛋白質及次生物質[20]。間接使這些次生物質作用于火力楠幼苗滲透，使這兩類外源物質處理后的電導率更低，變幅更小。本試驗結果還說明了4種外源物質過低或過高濃度處理下對火力楠幼苗的相對電導率影響較小甚至會加重幼苗受到的鹽害。

葉綠素質量分數影響植物光合作用強弱，是衡量植物代謝的重要指標，鹽脅迫下葉片中葉綠素質量分數會降低[21]，Rao等認為葉綠素的減少主要由于葉綠素酶對葉綠素b的降解所致[22]。本試驗中噴施外源物質后300 mmol·L-1NaCl處理下火力楠幼苗體內葉綠素質量分數各處理隨著鹽脅迫時間的增加呈下降趨勢，但差異不顯著，可能是鹽脅迫時間短而對葉綠素影響作用較小導致。

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內重要的滲透調節物質，為適應逆境條件，可主動積累[23]。本試驗中在外源物質作用下可溶性糖和蛋白質大量合成，調節細胞滲透功能以維持細胞穩態，這與宿越[24]等的結果一致。其中3 mmol·L-1MeJA處理對葉片中可溶性糖和蛋白質質量分數增加效果最佳。

植物抗氧化防御系統由抗氧化酶活性和非酶抗氧化水平組成。大量研究表明，在鹽脅迫下，大多數植株中編碼抗氧化酶的基因(如SOD、POD和CAT)表達上調，如豌豆、北美豆梨等[25-26]；也有研究發現鹽脅迫下植物SOD、POD和CAT活性先上升后下降[27]。山思雨[28]等發現鹽脅迫下外源MeJA處理顛茄葉片的抗氧化酶活性均高于單鹽處理；MeJA對鹽脅迫下沙冬青幼苗也有同樣的作用[29]。本研究中在鹽脅迫下火力楠葉片的CAT、SOD活性均升高，POD活性先升高后下降，在施用外源MeJA后CAT活性變強，SA處理下POD、SOD活性明顯升高。鹽脅迫下3種抗氧化對鹽脅迫的作用機制不同導致酶活性表達有差異。CAT負責清除由光呼吸或脂肪酸氧化過程中形成的過氧化物；POD則主要催化H2O2、氧化酚類和胺類化合物；SOD是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶[30]。SA可通過調控信號分子代謝酶的活性而積累H2O2，H2O2作為第二信使誘導保護酶的合成[31]，這可能是SA相比其他3種外源物質對酶活性影響更顯著的原因。

綜上，適宜濃度或物質的量的外源甜菜堿、氯化鈣、水楊酸和茉莉酸對火力楠幼苗鹽脅迫均有緩解作用，經過綜合評價發現鹽脅迫下3 mmol·L-1茉莉酸甲酯、100 mg·L-1水楊酸、5 mmol·L-1氯化鈣處理均具有減少對火力楠幼苗傷害的功效，但鹽脅迫對植物的影響機制比較復雜，因此有關外源物質對火力楠生理生化的影響尚需要進一步研究。