胃癌組織SOX1和β-catenin的表達(dá)及其與臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后的相關(guān)性*

李臘秀，王科，趙家寧，任博，劉月紅

（1.西安市第四醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，陜西西安710004；2.重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶412060；3.西安市第四醫(yī)院輸血科，陜西西安710004；4.灃東新城公共衛(wèi)生管理中心，陜西西安710086）

胃癌是我國(guó)常見消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)的發(fā)病人數(shù)不斷增加且呈年輕化趨勢(shì)，但胃癌目前的早期診斷率較低、整體治療效果欠佳、預(yù)后情況較差[1-2]。多種參與癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲調(diào)控的基因均在胃癌組織中異常表達(dá)，但胃癌的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。性別決定區(qū)Y 框蛋白1（sex determining region Y-box 1,SOX1）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的基因，在食管癌、宮頸癌、肝癌中被證實(shí)呈低表達(dá)及過(guò)度甲基化[3-5]。已有胃癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)SOX1 能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，且這一抑制作用與抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達(dá)、拮抗βcatenin 介導(dǎo)的促癌效應(yīng)[6]。但SOX1 在胃癌中的表達(dá)及臨床病理意義均未明確。本研究擬探討胃癌組織中SOX1 和β-catenin 的表達(dá)及其與臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后的相關(guān)性，旨在闡明SOX1 靶向β-catenin在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月—2017年3月在西安市第四醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)或姑息性切除術(shù)的患者64 例。其中，男性38 例，女性26 例；年齡33～69 歲，平均（46.23±7.72）歲。均經(jīng)術(shù)后病理診斷為胃癌，臨床病理資料完整，術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。收集患者胃癌組織及距離腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

SOX1、β-catenin 的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，SP 二步法免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自上海邦奕生物公司，RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，正置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司，凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SOX1和β-catenin 的表達(dá)取胃癌組織和癌旁組織，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明浸蠟后進(jìn)行包埋，得到蠟塊備用。將蠟塊制成4 μm 厚度的切片，用二步法SP 法免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行染色，主要步驟為：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%過(guò)氧化氫孵育進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，抗原微波熱修復(fù)后一抗（SOX1、β-catenin 一抗的稀釋比例為1∶200）孵育4℃過(guò)夜，二抗、三抗孵育各1 h，DAB 顯色15 min 后蘇木精復(fù)染，脫水透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，SOX1 染色部位主要為細(xì)胞漿，β-catenin 染色部位主要為細(xì)胞核，參照王米娜[7]的研究評(píng)價(jià)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%為1 分，25%～<50%為2 分，50%～<75%為3 分，≥75%為4 分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，0～3 分為陰性、4～7 分為陽(yáng)性。

1.3.2 Western blotting 檢測(cè)SOX1、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量取胃癌組織和癌旁組織，采用RIPA 裂解液裂解組織，提取蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本加入SDS-PAGE 凝膠中，電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC 膜），用5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜2 h 后加入1∶1 000 稀釋的SOX1、β-catenin 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗（陰性對(duì)照），4℃孵育過(guò)夜；次日，TBS-T 溶液洗膜后室溫孵育1∶1 000 稀釋的HRP 二抗1 h，再次洗膜并在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，用Image J 軟件分析條帶灰度值，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算SOX1、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 遠(yuǎn)期生存的隨訪隨訪截止日期為2019年10月31日，通過(guò)查詢門診或住院資料、電話回訪的方式進(jìn)行生存情況隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁組織SOX1 和β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率及蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

胃癌組織與癌旁組織SOX1 和β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），胃癌組織SOX1 陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，胃癌組織β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織。胃癌組織與癌旁組織SOX1 和β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），胃癌組織SOX1 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，胃癌組織β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（見圖1、2 和表1）。胃癌組織SOX1 蛋白相對(duì)表達(dá)量與β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.347，P=0.017）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin的表達(dá)（免疫組織化學(xué)×400）

圖2 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin的蛋白表達(dá)

表1 胃癌組織及癌旁組織SOX1和β-catenin陽(yáng)性表達(dá)率及蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2 不同臨床病理特征胃癌組織SOX1 和βcatenin陽(yáng)性表達(dá)率的比較

不同腫瘤直徑的胃癌組織SOX1 和β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織SOX1陽(yáng)性表達(dá)率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低分化，TNM Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織SOX1的陽(yáng)性表達(dá)率低于中、高分化，TNM Ⅰ、Ⅱ期，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織。不同分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低分化，TNM Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織β-catenin 的陽(yáng)性表達(dá)率高于中、高分化，TNMⅠ、Ⅱ期，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織。見表2。

表2 不同臨床病理特征胃癌組織SOX1和β-catenin陽(yáng)性表達(dá)率的比較 例（%）

2.3 SOX1 和β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)、陰性表達(dá)患者總生存期的比較

SOX1 陰性表達(dá)患者與SOX1 陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.079，P=0.043），SOX1 陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期延長(zhǎng)；β-catenin 陰性表達(dá)患者與β-catenin陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.332，P=0.021），β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期縮短。見圖3、4。

圖3 SOX1陰性表達(dá)與陽(yáng)性表達(dá)患者的生存曲線

圖4 β-catenin陰性表達(dá)與陽(yáng)性表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

癌細(xì)胞過(guò)度的增殖、遷移、侵襲是胃癌重要的惡性生物學(xué)特征，多因素、多基因參與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的調(diào)控。β-catenin 是經(jīng)典Wnt 通路中重要的信號(hào)蛋白，也是目前已知重要的促癌蛋白，在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中均呈顯著高表達(dá)的趨勢(shì)[8-10]。β-catenin 在細(xì)胞核中能夠啟動(dòng)CyclinD1、c-myc、MMP-2等基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，進(jìn)而參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究對(duì)胃癌組織β-catenin 的分析顯示，胃癌組織β-catenin 的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，且與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明βcatenin的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

β-catenin 在惡性腫瘤中表達(dá)增多的機(jī)制復(fù)雜，其中SOX1可能是β-catenin的負(fù)性調(diào)控分子。研究證實(shí)[6]，過(guò)表達(dá)SOX1 能夠通過(guò)降低β-catenin 的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲；另有乳腺癌及鼻咽癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SOX1能夠抑制β-catenin的表達(dá)[11-12]。SOX1 介導(dǎo)的抑癌作用在近些年受到越來(lái)越多的關(guān)注，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)SOX1表達(dá)降低及過(guò)度甲基化與食管癌、宮頸癌、肝癌的發(fā)病有關(guān)[3-5]。本研究在既往關(guān)于SOX1研究的基礎(chǔ)上探討胃癌組織SOX1表達(dá)的變化：胃癌組織SOX1的陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁組織降低，且與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明SOX1 的低表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：胃癌組織SOX1 蛋白相對(duì)表達(dá)量與β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合SOX1 在離體胃癌細(xì)胞中對(duì)βcatenin 表達(dá)的抑制作用[6]推測(cè)，胃癌組織中低表達(dá)的SOX1 可能增加β-catenin 的表達(dá)并促進(jìn)了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

目前胃癌患者的整體預(yù)后情況較差，手術(shù)后的生存率較低，TNM 分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、幽門螺桿菌感染、原癌基因及抑癌基因表達(dá)異常均是影響胃癌患者預(yù)后及遠(yuǎn)期生存的相關(guān)因素[13-14]。本研究中，在明確SOX1 低表達(dá)及β-catenin低表達(dá)與胃癌發(fā)生及臨床病理特征惡化的關(guān)系后，進(jìn)一步對(duì)患者的總生存時(shí)間進(jìn)行隨訪，并比較SOX1和β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)、陰性表達(dá)患者總生存時(shí)間的差異，結(jié)果顯示：與SOX1 陰性表達(dá)患者比較，SOX1 陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期延長(zhǎng)；與β-catenin陰性表達(dá)患者比較，β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存期縮短。這說(shuō)明SOX1 低表達(dá)及β-catenin 高表達(dá)會(huì)使胃癌患者的總生存期縮短，與SOX1 低表達(dá)及β-catenin 高表達(dá)參與胃癌發(fā)生、臨床病理特征惡化的分析結(jié)果一致。

綜上所述，胃癌組織SOX1 的低表達(dá)與β-catenin的高表達(dá)有關(guān)，且與臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后的惡化相關(guān)，未來(lái)SOX1可能成為研究胃癌診療手段的新靶點(diǎn)。