幽門螺桿菌通過Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞侵襲及血管新生因子的作用研究*

趙越，馮菲，王軍，勾熙，舒小闖，蒲柯，彭宇奎，王玉平

（蘭州大學第一醫院1.消化科，2.超聲醫學科，甘肅蘭州730020）

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，發病率不斷升高，發病人群呈年輕化趨勢[1]。胃癌的發生涉及多因素、多環節、多基因，但具體機制并未完全闡明。幽門螺桿菌（helicobacter pylori,Hp）感染是引起胃癌的危險因素之一。Hp 感染后能夠引起宿主細胞中癌基因的表達，信號通路激活發生改變，進而引起細胞異常增殖、遷移、侵襲及血管新生[2-4]。Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路是與胃癌發生、發展密切相關的信號通路，上游信號分子Wnt3 及下游信號分子β-catenin 的表達在胃癌組織中升高，表達升高的β-catenin 進入細胞核后能夠調節多種侵襲基因表達，生成血管新生分子，進而促進胃癌細胞的侵襲、血管新生。有研究報道，Hp 感染能夠促進胃黏膜上皮GES-1 細胞中Wnt/β-catenin 信號通路的激活[5]。但Hp 感染是否直接促進胃癌細胞中Wnt/βcatenin 信號通路的激活以及是否通過Wnt/β-catenin信號通路調節胃癌細胞侵襲、血管新生均未闡明。為此，本實驗將以胃癌細胞株SGC-7901 為對象，具體分析Hp通過Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞侵襲及血管新生能力的調節作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本及分組收集2015年5月—2018年12月在蘭州大學第一醫院手術切除的胃癌蠟塊樣本84例，根據Hp感染情況分為Hp陰性胃癌組織45 例及Hp陽性胃癌組織39 例。

1.1.2 細胞胃癌細胞株SGC-7901 購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.3 HpHp 標準菌株購自北京NTCC 中國質粒載體菌種細胞基因保藏中心。

1.1.4 試劑石蠟包埋組織切片總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成預混試劑盒、Talent 熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司，Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑ICG-001、結晶紫購自美國Sigma 公司，RIPA 裂解液購自上海碧云天公司，兔來源Wnt1、Wnt3a、β-catenin、基質金屬蛋白酶7（MMP-7）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏蛋白（Ecadherin）的單克隆一抗購自美國Abcam 公司，血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管生成素-2（Ang-2）的酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自上海西唐公司。

1.1.5 儀器細胞培養箱購自美國Thermo 公司，顯微鏡購自日本Nikon 公司，凝膠成像儀購自美國Bio-rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織中目的基因mRNA相對表達量的檢測取胃癌蠟塊標本，采用石蠟包埋組織切片總RNA 提取試劑盒分離RNA，采用cDNA 第一鏈合成預混試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，采用Talent 熒光定量檢測試劑盒對cDNA 中的目的基因Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、E-cadherin、VEGF、bFGF、Ang-2及內參基因β-actin進行PCR 反應，得到反應曲線及循環閾值，以β-actin為內參計算目的基因mRNA 的相對表達量。

1.2.2 Hp培養基菌體提取物制備將Hp菌株接種在含有10%胎牛血清的布氏肉湯培養基中，在微需氧、37℃環境下培養48 h，離心收集細菌后用磷酸鹽緩沖溶液重懸，4℃保存備用。

1.2.3 細胞培養、分組及處理SGC-7901 細胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養，細胞鋪滿底面80%后用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，傳代細胞接種在培養板中并分組處理。對照組用不含細菌及藥物的DMEM 處理，連續處理24 h；Hp組加入感染復數100∶1的Hp 菌液進行處理，連續處理24 h；Hp+ICG-001 組預先用含有4 μmol/L ICG-001 的DMEM 處理12 h，而后再加入感染復數100∶1 的Hp 菌液并繼續處理24 h。

1.2.4 Western blotting 檢測采用RIPA 裂解液裂解分組處理后的細胞，提取蛋白后進行Western blotting 檢測。測定蛋白含量后取30 μg 蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后電轉移至NC 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后4℃孵育Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、E-cadherin 的單克隆一抗過夜；第2 天室溫孵育HRP 二抗1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值計算蛋白相對表達量。

1.2.5 Transwell 檢測細胞侵襲活力在預涂基質膠的Transwell 小室中檢測細胞侵襲活力，在上層小室內接種細胞并按分組方法進行處理，在下層小室內加入含有10%胎牛血清的DMEM 誘導細胞侵襲。分組處理24 h 后，取出小室，用棉簽擦未侵襲的細胞，結晶紫染色后在顯微鏡的高倍視野下觀察侵襲細胞數目。

1.2.6 血管新生分子含量的檢測采用酶聯免疫吸附試驗檢測分組處理后細胞培養基中血管新生分子VEGF、bFGF、Ang-2 的含量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hp 陰性和Hp 陽性胃癌組織中目的基因相對表達量的比較

與Hp 陰性胃癌組織比較，Hp 陽性胃癌組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、N-cadherin、VEGF、bFGF、Ang-2 的mRNA相對表達量均升高（P<0.05），E-cadherin mRNA 的相對表達量降低（P<0.05）。見表1。

表1 Hp陰性和陽性胃癌組織中目的基因mRNA相對表達量的比較 （±s）

表1 Hp陰性和陽性胃癌組織中目的基因mRNA相對表達量的比較 （±s）

組別Wnt1 mRNA Wnt3a mRNA β-catenin mRNA MMP-7 mRNA N-cadherin mRNA E-cadherin mRNA VEGF mRNA bFGF mRNA Ang-2 mRNA Hp陰性胃癌組織Hp陽性胃癌組織t 值P 值0.73±0.15 1.32±0.24 13.697 0.000 0.69±0.12 1.29±0.34 11.077 0.000 0.81±0.19 1.24±0.28 8.134 0.000 0.75±0.13 1.38±0.31 12.438 0.000 0.66±0.19 1.40±0.35 12.258 0.000 1.31±0.41 0.79±0.24 7.206 0.000 0.59±0.09 1.49±0.52 11.424 0.000 0.65±0.08 1.43±0.34 14.932 0.000 0.82±0.18 1.27±0.33 7.896 0.000

2.2 Hp 對SGC-7901 細胞中Wnt/β-catenin 信號通路的影響

3 組SGC-7901 細胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 蛋白相對表達量的比較，差異有統計學意義（F=7.615、9.283 和7.953，均P=0.000）。進一步兩兩比較t檢驗，Hp組SGC-7901細胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量較對照組明顯增加（P<0.05）；Hp+ICG-001組SGC-7901 細胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 蛋白相對表達量較Hp組明顯減少（P<0.05）。見表2和圖1。

圖1 3組Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量的比較

表2 3組細胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin相對表達量的比較 （±s）

表2 3組細胞中Wnt1、Wnt3a、β-catenin相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與Hp組比較，P<0.05。

組別β-catenin蛋白Wnt1蛋白Wnt3a蛋白對照組Hp組Hp+ICG-001組F 值P 值1.19±0.32 1.84±0.52①1.33±0.36②7.953 0.000 1.20±0.27 1.82±0.34①1.24±0.32②7.615 0.000 1.23±0.35 2.03±0.52①1.44±0.41②9.283 0.000

2.3 Hp 通過Wnt/β-catenin 信號通路增強SGC-7901細胞的侵襲活力

對照組SGC-7901 細胞侵襲數目為（24.10±6.59），Hp 組為（71.93±11.58），Hp+ICG-001 組為（34.12±9.39），3 組比較經方差分析，差異有統計學意義（F=13.474，P=0.000）。進一步兩兩比較t檢驗，Hp組SGC-7901 細胞的侵襲數目較對照組明顯增加（P<0.05）；Hp+ICG-001 組SGC-7901 細胞的侵襲數目較Hp組明顯減少（P<0.05）。見圖2。

圖2 3組細胞的結晶紫染色結果（A）及侵襲活力比較(B)

2.4 Hp 通過Wnt/β-catenin 信號通路增加SGC-7901細胞中MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對表達量

3 組SGC-7901 細胞中MMP-7、N-cadherin、Ecadherin蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=16.585、16.585 和14.557，均P=0.000）。經LSD-t法兩兩比較，Hp 組SGC-7901 細胞中MMP7、N-cadherin 蛋白相對表達量較對照組增加（P<0.05），E-cadherin 蛋白相對表達量較對照組減少（P<0.05）；Hp+ICG-001組SGC-7901 細胞中MMP-7、N-cadherin 蛋白相對表達量較Hp組減少（P<0.05），E-cadherin蛋白相對表達量較Hp組增加（P<0.05）。見表3和圖3。

圖3 3組細胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對表達量的比較

表3 3組細胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對表達量的比較 （±s）

表3 3組細胞MMP-7、N-cadherin、E-cadherin蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與Hp組比較，P<0.05。

組別E-cadherin蛋白MMP-7蛋白N-cadherin蛋白對照組Hp組Hp+ICG-001組F 值P 值1.21±0.32 0.36±0.09①1.02±0.20②14.557 0.000 0.23±0.08 0.83±0.19①0.45±0.09②16.585 0.000 0.32±0.07 0.91±0.21①0.28±0.06②13.018 0.000

2.5 Hp 通過Wnt/β-catenin 信號通路增加SGC-7901細胞中血管新生因子的生成

3 組SGC-7901 細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2 含量的比較，差異有統計學意義（F=13.737、9.283 和11.384，均P=0.000）。進一步兩兩比較t檢驗，Hp 組SGC-7901 細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量較對照組增加（P<0.05）；Hp+ICG-001組SGC-7901細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2的含量較Hp組減少（P<0.05）。見表4和圖4。

圖4 3組細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比較

表4 3組細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比較 （±s）

表4 3組細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2含量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與Hp組比較，P<0.05。

組別Ang-2/（ng/ml）VEGF/（ng/ml）bFGF/（pg/ml）對照組Hp組Hp+ICG-001組F 值P 值1.01±0.23 2.65±0.62①1.72±0.36②11.384 0.000 1.33±0.29 4.23±0.92①1.94±0.45②13.737 0.000 16.69±3.25 42.39±8.79①27.67±7.14②9.283 0.000

3 討論

Wnt/β-catenin 信號通路是與多種惡性腫瘤發生、發展密切相關的信號通路，Wnt1、Wnt3a 是該信號通路經典的上游信號分子，高表達的Wnt1、Wnt3a 與膜受體Lrp5/6 結合后使細胞內的GSK-3β發生磷酸化，磷酸化的GSK-3β 失去水解β-catenin的活性，進而引起細胞內β-catenin 增多并不斷向核內轉移，進入細胞核的β-catenin 能夠調節多種癌基因的表達并引起細胞的惡變[6-8]。胃癌與Wnt/β-catenin 信號通路的關系也被多項研究證實[9-10]，但胃癌組織中該通路發生激活的機制尚未完全明確。

Hp 感染是目前已知與胃癌發生密切相關的危險因素，Hp 感染胃黏膜上皮細胞后，細胞中多種基因的表達發生改變，進而可造成相應細胞學行為的變化[4,11]。吳鶯等[5]以人胃黏膜上皮細胞GES-1為對象的細胞實驗證實，Hp 感染GES-1 細胞后，細胞中β-catenin 的表達明顯增多，提示Hp 感染與Wnt/β-catenin 信號通路的激活有關。本實驗首先分析胃癌組織中Hp 感染與Wnt/β-catenin 信號通路激活的關系， 結果發現Hp 陽性胃癌組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin 的mRNA 相對表達量明顯高于Hp 陰性胃癌組織。在該基礎上，本實驗以胃癌SGC-7901 細胞為對象，用Hp感染后觀察Wnt/βcatenin 信號通路的變化。本實驗的觀察結果顯示：Hp 感染后細胞中Wnt1、Wnt3a 及β-catenin 蛋白相對表達量均明顯增加，說明Hp 感染能夠激活胃癌細胞中Wnt/β-catenin 信號通路，激活Wnt/β-catenin信號通路也可能是Hp 感染參與胃癌發生、發展的機制。

為進一步驗證Hp 感染是否通過激活Wnt/βcatenin 信號通路參與胃癌的發生、發展，本實驗在Hp 感染的基礎上加用Wnt/β-catenin 信號通路的抑制劑ICG-001 并觀察細胞侵襲、血管新生能力的變化。Hp 感染后，細胞侵襲數目明顯增多；而在加用ICG-001 后，Hp 感染增加細胞侵襲數目的效應明顯減弱，說明Hp 感染通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進胃癌細胞的侵襲。已有研究報道，Wnt/β-catenin 信號通路激活后能夠增加下游MMP-7、N-cadherin 的表達，同時抑制E-cadherin 的表達，促進細胞外基質的水解及細胞上皮間質的轉化，進而增強細胞的侵襲能力[13-14]。本實驗通過檢測上述蛋白表達的變化來進一步驗證Hp 感染調控胃癌細胞侵襲的作用及機制可知：Hp 感染后，細胞中MMP-7、N-cadherin 蛋白相對表達量增加，Ecadherin 的相對表達量減少；而在加用ICG-001 后，Hp 感染調節上述蛋白表達的作用減弱，這一結果與細胞侵襲數目的變化結果一致，進一步驗證了Hp 感染通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進胃癌細胞侵襲的作用。

腫瘤血管新生是胃癌局部病灶內重要的惡性生物學行為之一，同時也是癌細胞增殖、侵襲的重要病理基礎。Wnt/β-catenin 信號通路所調控的VEGF、bFGF、Ang-2 與血管新生密切相關，能夠刺激內皮細胞的增殖和血管樣結構的形成。已有研究報道，胃癌患者血清中VEGF、bFGF、Ang-2的含量均明顯增多[14-16]。本實驗對血管新生因子的觀察發現：Hp 感染后，細胞培養基中VEGF、bFGF、Ang-2 的含量增加；而在加用ICG-001 后，Hp 感染增強VEGF、bFGF、Ang-2 生成的作用減弱，Hp感染通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進胃癌細胞中血管新生因子的生成、增強細胞的血管新生能力。

綜上所述，Hp 能夠激活胃癌細胞中Wnt/βcatenin 信號通路并增強細胞的侵襲能力、血管新生能力。激活Wnt/β-catenin 信號通路是Hp 感染增強胃癌細胞侵襲及血管新生能力的分子機制之一。