針刺捻轉補瀉法對自發性高血壓大鼠海馬丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶含量的影響

薛艷君 吳嬌娟 張旭東 蔚鵬程 吳小麗 劉清國

北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029

高血壓是一種以原因不明的體循環動脈壓升高為主要表現的臨床綜合征，其患病率在全球范圍內呈增長趨勢[1]，可造成嚴重的心、腦、腎等靶器官損害[2-3]。目前西醫主要以口服降壓藥來控制血壓，但長期服藥副作用大，而針刺療法相對簡便、安全。研究發現[4-5]，針刺太沖穴可通過調控內分泌、神經系統和細胞轉導通路等方式保護心、腦、腎等靶器官，實現降壓目的。捻轉補瀉法作為傳統針刺手法之一，施以合適的手法操作可以提高針刺療效[6]。本課題組前期研究發現，針刺捻轉補瀉法作用于太沖穴可起到降壓效果且對腦區的生化指標有影響，且與捻轉補法比較，捻轉瀉法的降壓效果較好[7-12]。但目前關于針刺捻轉補瀉法降壓的研究較少，其機制尚不清楚，需要深入挖掘。相關研究表明，高血壓狀態下，腦部氧化應激水平增強，導致與控制認知功能相關的海馬發生神經退行性病變[13]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）為衡量氧化應激反應的標志物，有研究發現，針刺可以通過調節其含量來提高機體的抗氧化能力，實現降壓目的[14-15]。因此，本研究以自發性高血壓大鼠為模型，通過觀察不同針刺手法下其海馬的組織形態及海馬中MDA、GSH-Px 含量的變化，探討針刺捻轉補瀉法對高血壓海馬損傷的相關防護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級9 周齡雄性自發性高血壓大鼠18 只（實驗動物質量合格證編號：11400700317072），Wistar-Kyoto（WKY）大鼠6 只（實驗動物質量合格證編號：114007 00312513），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2006-0006，平均（220±15）g。所有大鼠在北京中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物實驗室飼養（動物保護與倫理批準號：BUCM-4-2018061501-2058）。適應性喂養1 周后，采用隨機數字表法，將自發性高血壓大鼠分為瀉法組、補法組、模型組，每組6 只，另取6 只WKY 大鼠作為空白組。

1.2 主要儀器和試劑

漢醫牌針灸針（規格：0.18 mm×13 mm，北京漢醫醫療器械有限責任公司）；ACX-XM 計重電子秤（精密度：0.01 mg，上海升亮電子科技有限公司）；Leica UC7 超薄切片機（德國徠卡公司）；顯微鏡（自動化智能型正置研究級顯微鏡，BX53，日本奧林巴斯）；高速冷凍離心機（20PR-52D，日本日立）；電熱恒溫培養箱（DH4000A，天津泰斯特儀器有限公司）。主要試劑盒：MDA 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A003-1）；GSH-Px 試劑盒（南京建成生物工程研究所，A005-50）。

1.3 方法

太沖穴取穴參照《實驗針灸學》[16]教材大鼠標準穴位圖譜定位，于后肢足背1、2 跖骨凹陷處取太沖穴。針刺方法如下，①瀉法組：右手為刺手，直刺雙側太沖穴1～2 mm，行捻轉瀉法（先左側后右側），拇指向后時用力重，向前退回力輕，幅度360°，60 次/min，持續3 min，留針20 min，治療14 d。②補法組：右手為刺手，直刺雙側太沖穴1～2 mm，行捻轉補法（先左側后右側），拇指向前時用力重，向后退回力輕，幅度360°，60 次/min，持續3 min，留針20 min，治療14 d。針刺時間集中在每天下午2:00—4:00 之間，所有操作由同一人完成。③模型組和空白組每日在相同時間進行相同穴位的抓取固定刺激。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 HE 染色觀察海馬形態學變化 干預結束后第15 天，大鼠稱重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后迅速固定，斷頭取腦，剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦組織，取下海馬，移入4%多聚甲醛固定24 h。經脫水、透明、浸蠟后常規包埋，用切片機切成4 μm 薄片，烘烤后將切片依次置于二甲苯、無水乙醇、酒精、蒸餾水中脫蠟，用蘇木精染色細胞核6 min，水洗后用0.6%氨水返藍，流水沖洗，伊紅染色細胞質3 min，脫水后用二甲苯透明樹膠封片，最后將切片置于顯微鏡下（400×）觀察。

1.4.2 海馬區MDA、GSH-Px 含量測定 干預結束后第15 天，大鼠稱重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后迅速固定，斷頭取腦，于冰臺上剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦組織，取下海馬，經生理鹽水漂洗后裝于標記好的EP 管，迅速投入液氮中備用。將海馬組織和生理鹽水按1∶9 的比例制備10%組織勻漿，后取勻漿于離心機3000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心20 min，取上層清液，嚴格按照MDA、GSH-Px 試劑盒的要求步驟操作，測定其在海馬中的表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組海馬齒狀回區HE 染色結果

空白組細胞結構完整，形態規則，細胞間隙正常，多數細胞核深染，核仁清晰，未見變性壞死；與空白組比較，模型組染色明顯變淺，出現核固縮、細胞溶解碎裂、空泡樣變性和凋亡細胞。與模型組比較，瀉法組和補法組均可見細胞輪廓較清晰，細胞染色加深，核仁清晰，細胞結構基本正常。見圖1。

圖1 各組海馬齒狀回區HE 染色（400×）（n=6）

2.2 各組海馬中MDA、GSH-Px 含量比較

模型組MDA 含量高于空白組，GSH-Px 含量低于空白組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。補法組、瀉法組MDA 含量均低于模型組，GSH-Px 含量均高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 各組海馬中MDA、GSH-Px 含量比較（）

表1 各組海馬中MDA、GSH-Px 含量比較（）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。MDA：丙二醛；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶

3 討論

高血壓是現代醫學名詞，中醫古籍中未曾有高血壓的記載，據其臨床表現，可將其歸為中醫病證中的“頭痛”“眩暈”等范疇。《素問·至真要大論》中“諸風掉眩，皆屬于肝”，《靈樞·口問》中“故上氣不足，腦為之不滿，耳為之苦鳴，頭為之苦傾，目為之眩”，《景岳全書》指出“眩暈一證，虛者居其八九，而兼火兼痰者，不過十中一二耳”，并強調“無虛不作眩”。根據歷代醫籍對高血壓相關病證的描述，高血壓可以分為虛、實兩大類。捻轉補瀉法起源于《內經》，是根據“盛則瀉之，虛則補之”理論確立的兩種不同治療方法。自發性高血壓是目前最成熟、應用最多的高血壓模型，廣泛應用于高血壓發病、靶器官損害機制的探究及降壓藥物的篩選[17]。通過觀察自發性高血壓大鼠的證候特征發現，自發性高血壓大鼠易激惹、煩躁，具有典型的肝陽上亢表現[18]。太沖穴既為肝經原穴，又為肝經腧穴，具有平肝潛陽、疏肝解郁、養血柔肝的功效，是治療高血壓的首選穴之一[19-21]。因此本研究以自發性高血壓大鼠為模型，以針刺捻轉補瀉太沖穴為干預方式，前期研究顯示[22]，針刺捻轉瀉法作用于自發性高血壓大鼠太沖穴的降壓效果優于捻轉補法，這與中醫傳統思想“實則瀉之”一致。

氧化應激參與高血壓及其靶器官腦損害的過程，大腦的神經細胞膜中含有豐富的不飽和脂肪酸，在高血壓影響下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量明顯增加，氧自由基作用于這些脂肪酸可以引發脂質過氧化反應，同時過多的ROS 會通過破壞血管內皮功能、降低壓力感受器的敏感性，激活交感神經系統等方式來升高血壓，導致惡性循環[23-25]。氧化應激所衍生的腦損傷主要位于控制認知功能的腦區[13]。海馬是主管認知功能的腦區之一，研究發現[26-28]，在高血壓狀態下，海馬灌注和神經樹突結構發生改變，海馬神經突觸密度降低，最終造成認知功能障礙。此外，有學者通過核磁共振技術觀察到，高血壓狀態下，海馬區的主要代謝成分發生異常改變[29]。

MDA 是常用的細胞膜脂過氧化指標，氧自由基作用于脂質發生氧化反應，最終產物為MDA，其還能加劇細胞膜的損傷，通過檢測MDA 可以了解機體的抗氧化能力。研究發現[30]，MDA 含量的增加與高血壓患病風險有關。針刺可以通過降低自發性高血壓大鼠腎臟組織、延髓頭腹端外側區的MDA 含量，提高機體抗氧化能力，最終實現降壓目的[31-32]。GSH-Px 是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，具有特異性催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的反應、防止自由基對細胞膜的損害、保護血管內皮功能，降低血壓的作用[33]，其是機體抗氧化能力的指標之一。有研究報道[34]，針刺可以增強高血壓大鼠體內GSH-Px 的活性，改善氧化水平，使大鼠血壓得到控制。

因此，本研究以海馬為切入點，通過觀察海馬組織MDA、GSH-Px 的含量變化，探討針刺捻轉補瀉法對高血壓海馬損害的防護機制。本實驗結果顯示，與模型組比較，針刺捻轉補瀉法作用于自發性高血壓大鼠雙側太沖穴，在改善海馬組織損傷的同時，可以顯著降低MDA，提升GSH-Px。提示針刺捻轉補瀉法可通過調節MDA、GSH-Px 的含量，提高抗氧化能力，減緩高血壓海馬損傷程度。高血壓海馬損傷是一個受多種因素影響的復雜過程，本研究著重關注了針刺捻轉補瀉法調節相關氧化應激指標對高血壓海馬損傷起到的作用，尚有局限性。接下來的研究可對針刺捻轉補瀉法調控高血壓海馬損傷的其他可能途徑做更深入的探索。