加權基因共表達網絡分析篩胃癌相關分子

肖又德 鄭永法 戈 偉

1.泰康同濟（武漢）醫院腫瘤科，湖北武漢 430000；2.武漢大學人民醫院腫瘤科，湖北武漢 430000

胃癌（gastric cancer）是世界上癌癥相關性死亡的常見原因之一，其病死率位居癌癥病死率的第三位[1]，盡管以手術結合化療的方案廣泛應用于胃癌的治療，但胃癌的5 年生存率依然較低[2-3]?；蛐酒壳皬V泛應用于包括癌癥在內的多種復雜疾病的診斷、預測以及藥物篩選等領域[4-6]。但傳統的篩選差異基因表達極易遺漏調控過程中的核心分子。通過系統的繪制個體生物網絡互作圖可以精準找出與預后相關的核心分子[7-8]，加權基因共表達網絡分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）可以有效解決上述問題[9-10]。本研究擬利用該方法篩選更為有效的胃癌分子標志物。

1 資料與方法

1.1 數據集獲取

從TCGA 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/，檢索時間：建庫至2020 年11 月14 日）中下載胃癌患者的RNA-seq 數據及其臨床資料，并剔除生存情況及病理分期不明的患者，最終納入359 例胃癌患者。同時 從GEO 數 據 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，通過關鍵詞（胃癌、生存和基因芯片）檢索篩選帶有生存數據的胃腺癌數據集，且數據集能獲得標準化的注釋文件，獲取兩個數據集（GES15459 和GSE22377，檢索時間：建庫至2020 年11 月14 日），用于外部驗證胃癌患者的預后。含有多種癌癥組織和癌 旁 組 織 的ONCOMINE 數 據 庫（https：//www.oncomine.org）也用于外部驗證。

1.2 基因共表達網絡構建

WGCNA 是一種常用的模塊化分析技術，已被用于識別和篩選復雜疾病的生物標志物或藥物靶點[11]。首先，通過R 軟件中的“WGCNA”分析包構建基因共表達網絡[8,12]。然后，建立兩個基因之間的相關矩陣，通過對網絡拓撲結構分析，確定軟閾值大小，將鄰接轉化為拓撲重疊矩陣（TOM），TOM 可以度量1個基因的網絡連通性[7,13]。為了將表達譜相似的基因分類到基因模塊（ME）中，基于TOM 的差異測度進行平均連鎖層次聚類[8,12]。模塊鑒定后，采用t 檢驗計算組間各基因表達顯著性檢驗的P 值。為進一步分析模塊特征基因的差異性，為模塊樹狀圖選擇一條切線，并合并部分模塊。

1.3 特征模塊和核心基因篩選

對每個ME 進行分析時，通過Pearson 相關檢驗來評估MEs 與轉移的相關性，以確定相關模塊（各模塊在各個樣本上Pearson 系數絕對值相加為最高者認定為響應系數最高模塊）。選擇與轉移高度相關的模塊作為轉移模塊進行分析。利用STRING 網站進行蛋白-蛋白的互作（PPI）分析（選擇連接數最大10個），并利用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件進一步分析。同時利用R 軟件的LASSO 回歸分析包篩選轉移模塊中基因。

1.4 GO 功能學、KEGG 通路分析和GSEA 分析

為了解轉移模塊涉及的功能學和通路。采用標準富集計算方法進行GO 功能分析和KEGG 通路分析用以篩選與其相關的功能和通路。為了解核心分子在胃癌患者中的潛在功能，利用TCGA 胃癌患者數據集進行GSEA 分析。將P<0.05 和|富集評分（ES）|>0.3作為截止標準。

1.5 統計學方法

采 用SPSS 24.0、GraphPad Prism 7.0 和R 3.4.1軟件進行數據分析，同時用上述軟件進行圖像生成處理。組間比較采用t 檢驗?；蜃罴呀攸c取值，利用X-Tile 軟件，基于最小P 值和最大Log-rank χ2值進行分析計算[14]。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，評估核心靶基因的預測能力，利用曲線下面積（AUC）評估敏感度和特異性。K-M 法繪制生存曲線，預測基因對患者預后的影響。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料

本研究共納入359 例胃癌患者進行分析，其中男230 例，女129 例；年齡（65.7±10.9）歲；腫瘤位置：近端87 例，胃體134 例，遠端131 例，未知7 例；腫瘤組織學分級：G18 例，G2128 例，G3215 例，GX8 例；病理分期：Ⅰ期53 例，Ⅱ期116 例，Ⅲ期152 例，Ⅳ期38 例。

2.2 構建共表達模塊結果

WGCNA 方法將基因進行模塊化富集分析（圖1，封三），共篩選16個相應的ME，見圖2（封三），依據各模塊在各個樣本上Pearson 系數篩選獲取了BLUE模塊，BLUE 模塊共含有2078個基因。

圖1 基因共表達網絡分析模式圖

圖2 各模塊相關分析圖

2.3 BLUE 模塊相關功能分析及核心分子篩選結果

BLUE 模塊中相關基因篩選表達響應基因參與的信號通路關聯提示，主要與蛋白磷酸化異常、蛋白激酶活化等相關，見圖3（封三）。PPI 和MOCDE 插件篩選位于調控核心位置的基因，見圖4。LASSO 分析篩選出19個與預后相關的靶基因（DUSP16、NUP50、CDC5L、PTPRF、KBTBD2、SLC11A2、DHX15、ACBD5、RMI1、TRIM25、C3orf38、MSI2、VPS35、RNF43、PACRGL、GMCL1、SMAD5、IMPACT、IDE）。將上述3種方法篩選的結果進行綜合分析，獲得CDC5L。

圖3 BLUE 模塊中GO 和KEGG 分析

圖4 蛋白互作分析

2.4 CDC5L 驗證結果

CDC5L 表達量為7.2 時為最佳截點，見圖5（封三）。低表達CDC5L 患者的總生存率高于高表達患者（P=0.038），見圖6。為了解CDC5L 表達量在患者TNM 分期中的作用，對其分層分析，結果提示其Ⅰ、Ⅱ期低表達CDC5L 患者總生存率高于高表達患者（P=0.06、0.03），見圖7。CDC5L 顯示出較強的預測胃癌轉移患者能力（AUC=0.745），見圖8。ONCOMINE數據庫對CDC5L 基因進行meta 分析發現，納入的33個數據集中，癌組織中CDC5L 表達量高于癌旁組織（P <0.001），見圖9。GEO 數據庫驗證結果顯示，低表達CDC5L 的胃癌患者有著更好的預后，見圖10。

圖5 X-tile軟件選取得CDC5L最佳截點

圖6 不同CDC5L 表達情況胃癌患者生存分析曲線

圖7 不同病理分期胃癌患者生存分析曲線

圖8 CDC5L 預測胃癌轉移的ROC 曲線

圖9 胃癌和癌旁組織中CDC5L 表達比較

圖10 CDC5L 在GEO 數據集的驗證結果

2.5 GSEA 功能學分析結果

結果顯示，CDC5L 主要涉及細胞周期調控以及糖代謝通路。見圖11。

圖11 GSEA 分析功能學分析結果

3 討論

胃癌是世界上癌癥相關性死亡的常見原因之一，盡管目前以手術結合化療/免疫治療/靶向治療等多種方案已廣泛應用于胃癌的治療當中，但胃癌的五年生存率依然低下[2-3]。這主要是因為大多數胃癌患者被發現時已處于中晚期，造成其預后不佳[15]。晚期轉移性胃癌患者五年生存率不足10%[16-17]。為更早地識別具有高危轉移風險的胃癌患者，本研究利用TCGA 數據集，通過精準的WGCNA 方法識別出CDC5L 與胃癌患者預后相關，同時其能夠較好地預測早期胃癌患者是否發生轉移；內部和外部數據集同時驗證CDC5L 具有較強的重復性和可靠性。

CDC5L 是G2/M 轉變所必需的細胞周期調節劑[18-20]。CDC5L 通過與細胞周期檢查點蛋白ATR 相互作用，激活ATR 下游效應因子，干擾CDC5L 表達使S期細胞周期檢查點失活，從而增加藥物敏感性[21-22]。研究顯示[23-25]，CDC5L 在肝癌、口腔鱗癌和神經母細胞瘤中也發揮了作用。但目前尚無CDC5L 在胃癌中的作用及相關機制的報道。本研究結果顯示，CDC5L 能較好地預測胃癌患者生存及轉移發生情況。外部ONCOMINE 數據庫發現，CDC5L 在癌組織中高表達。GEO 數據集驗證了低表達CDC5L 胃癌患者有更好的預后。因此，本研究結果對未來探索CDC5L 與胃癌患者不良預后奠定了一定的基礎。但不可否認的是，本研究結果還需進一步在臨床樣本中獲得更為可靠的驗證，以及通過體內/外實驗驗證CDC5L 的臨床和生物學意義。

總之，本研究通過WGCNA 等生物信息學方法利用TCGA 數據庫發現CDC5L 高表達與較差預后相關。利用外部數據集對上述結果驗證，發現CDC5L 在癌組織中高表達。CDC5L 有可能成為新的預后指標，有助于胃癌患者個性化治療及臨床預后判斷。