miR-96干擾NKD2表達對骨肉瘤MG63細胞株的增殖、凋亡的影響

張建業，張衛華

(武漢科技大學附屬漢陽醫院，武漢市漢陽醫院骨一科，湖北 武漢 430000)

骨肉瘤是一種常見于兒童及青少年的惡性腫瘤，其發病率居小兒骨惡性腫瘤首位[1]。骨肉瘤細胞來源于間質細胞，由于腫瘤可直接或間接由軟骨形成腫瘤骨樣組織及骨組織，故骨肉瘤生長迅速嚴重危害患者生活質量與生命安全[2]。微小RNA(microRNA，miR)是一類長度約為21nt的小分子RNA，miR是一種內源性非編碼RNA分子，但其可通過調節蛋白質的合成，進而參與多個細胞生物活動過程[3]。既往研究顯示，miR-96在胃癌[4]、肝癌[5]、宮頸癌[6]等多種惡性腫瘤中呈異常表達。裸露角質蛋白同源物2(naked cuticle homolog 2，NKD2)是Wnt信號通路的下游靶基因，研究發現其對結腸癌[7]、胃癌[8]細胞的增殖與侵襲具有調控作用。但關于miR-96與NKD2對骨肉瘤細胞增殖與生長的影響，及其兩者的相互作用尚不明確。故本研究旨在探究miR-96通過NKD2的表達對骨肉瘤MG63細胞株的增殖、凋亡的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析我院2013年9月至2018年2月收集的骨肉瘤標本57例臨床資料作為研究組，同時收集距腫瘤邊界5cm的癌旁組織作為對照組。納入標準：(1)經病理學檢查確診為骨肉瘤；(2)本次治療前未接受放療、化療及其他系統抗癌治療。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并糖尿病、高血壓等全身性疾病；(3)心、肝、腎等重要臟器存在嚴重功能障礙。其中男性39例，女性18例；年齡21～49歲，平均年齡(28.16±6.73)歲。世界衛生組織(world health organization，WHO)標準分型：小圓細胞型2例，軟骨母細胞型6例，血管擴張型4例，纖維母細胞型5例，骨母細胞型40例。本研究符合本院醫學倫理委員會相關規定。

1.2 主要儀器與試劑 人正常成骨細胞系hF0B1.19和人骨肉瘤MG63細胞株：購自上海聯邁生物工程有限公司。恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHP-9012)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀(上海宏石醫療科技有限公司，型號：SLAN-96P)；流式細胞儀(德國貝克曼庫爾特，型號：FC500)；組織裂解液、細胞裂解液(上海信裕生物科技有限公司)；Trizol試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)；達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)高糖細胞(上海冠導生物工程有限公司)；miR-96抑制劑(武漢博歐特生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(焦作路非凡生物科技有限公司)；兔抗人NKD2單克隆抗體、羊抗兔IgG(北京紐樸生物技術有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyltetrazolium assay，MTT)(上海恪敏生物科技有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(上海嶸崴達實業有限公司)；超敏電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 骨肉瘤細胞培養及miR-96表達檢測 正常成骨細胞系hF0B1.19培養在10%胎牛血清DMEM高糖細胞培養液中，培養條件為：34 ℃、5% CO2；骨肉瘤細胞MG-63培養在10%胎牛血清培養基中培養，培養條件：37 ℃，5% CO2；轉染前一天進行細胞在培養板中接種，保證次日轉染時細胞處于對數生長期。次日取對數生長期的骨肉瘤細胞MG-63與正常成骨細胞系hF0B1.19，根據說明書采用TRIzol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳法評估RNA的完整性，把總RNA根據逆轉錄試劑盒說明書操作進行逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，參照RT-qPCR試劑盒說明書，采用RT-qPCR儀進行定量檢測。引物序列：miR-96正向5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。NKD2正向5'-GACTTTGGACCATGAAGACCAG-3'，反向5'-GCCCAGACGGAAGTTTCTTATT-3'。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，60 ℃退火34 s，共40個循環，采用U6作為內參，采用2-△△Ct法計算miR-96的相關表達量。

1.3.2 細胞分組 選取對數生長期骨肉瘤細胞MG-63，分為miR-96抑制組及空白對照組，應用LipofectaminTM2000說明書操作分別進行miR-96抑制組及空白對照組轉染，轉染24 h后分別采用RT-qPCR法與Western blot法檢測各組人骨肉瘤MG63細胞中miR-96與NKD2蛋白表達水平；采用MTT法檢測各組細胞增殖情況；采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況與細胞周期分布情況。

1.3.3 Western blot法檢測蛋白miR-96與NKD2表達 將組織與細胞充分裂解，離心后取上清液，提取其中總蛋白。總蛋白中加入上樣緩沖液后進行沸水浴10 min使蛋白充分變性，此后依次經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、轉膜、封閉、兔抗人NKD2單克隆抗體(貨號：AR1017)孵育、二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(貨號：BA1054)孵育，采用超敏ECL化學發光試劑盒進行蛋白檢測，用凝膠成像儀觀察結果。

1.4 觀察指標 骨肉瘤組織中miR-96與NKD2蛋白的表達情況；各組骨肉瘤細胞中miR-96與NKD2的表達情況；各組骨肉瘤細胞增殖、凋亡與細胞周期變化情況。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0數據軟件對本研究數據進行統計與分析。其中計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。設檢驗水準為0.05，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 骨肉瘤組織與癌旁組織中miR-96與NKD2蛋白的表達情況比較 RT-qPCR檢測結果顯示，骨肉瘤組織中miR-96表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；Western blot結果顯示，骨肉瘤組織中NKD2蛋白表達水平明顯低于癌旁組織，比較差異有統計學意義(P<0.05，見圖1)。

注：與癌旁組織比較*P<0.05

注：與空白對照組比較*P<0.05

圖3 兩組骨肉瘤細胞中NKD2的表達情況

2.2 骨肉瘤細胞中miR-96與NKD2的表達情況比較 miR-96抑制組骨肉瘤細胞中miR-96表達水平明顯低于空白對照組，比較差異具有統計學意義(P<0.05)；miR-96抑制組骨肉瘤細胞中NKD2表達水平明顯高于空白對照組，比較差異有統計學意義(P<0.05，見圖2～3)。

2.3 骨肉瘤細胞增殖情況比較 MTT比色檢測結果顯示，miR-96抑制組骨肉瘤MG63細胞株經miR-96抑制劑轉染48 h后，細胞相對吸光度(109.13±21.06)nm，未經miR-96抑制劑轉染的空白對照組細胞相對吸光度(172.50±18.33)nm，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，見圖4)。

注：與空白對照組比較*P<0.05

2.4 骨肉瘤細胞的凋亡情況比較 流式細胞儀檢測結果顯示，miR-96抑制組細胞凋亡率為(23.54±3.09)%，空白對照組細胞凋亡率為(1.79±0.62)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，見圖5)。

注：與空白對照組比較*P<0.05

2.5 骨肉瘤細胞周期變化情況比較 miR-96抑制組MG63細胞株處于G0/G1、S、G2/M期的細胞分別占比62.41%、33.47%、3.64%，空白對照組MG63細胞株處于G0/G1、S、G2/M期的細胞分別占比47.39%、25.18%、27.62%，兩組骨肉瘤MG63細胞株細胞周期情況比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

骨肉瘤是最常見的原發性骨惡性腫瘤之一[1]。由于腫瘤組織的浸蝕與骨皮質溶解，腫瘤部位疼痛成為骨肉瘤患者最常見的癥狀。此外，患者還伴有腫瘤部位腫脹、疼痛性跛行及發熱、體重下降、貧血等全身癥狀。骨肉瘤惡性程度高，預后極差，故而探究骨肉瘤的發病進程，找尋有效地治療方法是臨床亟需解決的問題。

近年來，miRNA在腫瘤中的表達及作用逐漸受到重視。研究報道，腫瘤組織與四周正常癌旁組織中對比有較多miRNA異常表達，而異常表達的miRNA可介導不同抑制癌及癌癥基因的表達，使細胞中的信號傳導通路或相關蛋白表達改變，從而發生抑癌或誘發癌癥進展，但具體作用仍在進一步研究中[9]。miR作為一類基因調控因子，可靶向一個或多個mRNA，通過抑制或斷裂靶標mRNAs而調節基因的表達，進而調控細胞生長、分化、凋亡與血管形成[10]。趙洪煥等[11]研究證明，miR可作為原癌基因或抑癌基因，在惡性腫瘤的發生、發展及轉移、侵襲過程中發揮重要作用，為腫瘤的靶向治療提供了新方向。趙新陽等[12]研究表明，miR-96在肝癌細胞表面呈高表達，且可促進肝癌細胞的遷移與侵襲。Rapti等[13]研究發現，miR-96在大腸癌中呈高表達，且高水平的miR-96提示患者預后不良。本研究結果顯示，骨肉瘤組織中miR-96表達水平明顯高于正常骨組織，提示miR-96在骨肉瘤組織中呈高表達。這與趙新陽[12]、Rapti等[13]的研究結果一致。Wnt信號通路在細胞增殖、器官形成、組織再生過程中具有重要作用，同時與多種惡性腫瘤的形成、發展有密切聯系[14]。NKD2是Wnt信號通路的負調控因子[15]。Zhang等[16]研究發現，NIKD2在肝癌中呈低表達，NKD2表達缺失導致肝癌細胞生長加速。本研究發現，骨肉瘤組織中NKD2表達水平明顯低于正常骨組織，提示NKD2在骨肉瘤中呈低表達。

體外細胞實驗結果顯示，miR-96抑制組骨肉瘤細胞中miR-96表達水平明顯低于空白對照組，且miR-96抑制組骨肉瘤細胞中NKD2表達水平明顯高于空白對照組，提示miR-96對NKD2的表達具有調控作用。細胞吸光度是指光線通過細胞前的入射強度與通過細胞后的透射光強比值，吸光度法是常用的細胞數量測量方法[17]。miR-96抑制組骨肉瘤MG63細胞株經miR-96抑制劑轉染48h后，細胞相對吸光度明顯低于空白對照組，miR-96抑制組骨肉瘤MG63細胞株細胞凋亡率明顯大于空白對照組，提示miR-96可促進人骨肉瘤MG63細胞增殖，同時抑制其凋亡。此外，本研究還發現，miR-96抑制組G0/G1期細胞率較空白對照組骨肉瘤MG63細胞株增加，但G2/M期細胞率較空白對照組減小。G0/G1期細胞停止細胞分裂，G2/M期細胞有絲分裂旺盛[18]。這進一步提示miR-96可增加骨肉瘤MG63細胞增殖活性。

綜上所述，miR-96在骨肉瘤組織中呈高表達，NKD2呈低表達；miR-96通過促進NKD2表達而促進骨肉瘤MG63細胞株早期凋亡；抑制骨肉瘤MG63細胞株生長；但關于NKD2是否成為骨肉瘤基因指標的潛在靶點還應當進一步研究確認。