柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的網絡藥理學和分子對接研究

盧玲，呂婷婷，黃其柳，黃小妹，宋曦，秦紅玲，刁麗梅*

(1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

顳葉癲癇是局灶性癲癇的一種常見類型，具有反復發作的特點，極易發展成藥物難治性癲癇[1]。顳葉癲癇患者可伴有認知功能障礙、焦慮、抑郁等并發癥，嚴重影響患者的工作、學習和生活質量[2]。長期使用傳統的抗癲癇藥物可導致衰老及認知功能障礙等。中醫藥治療癲癇歷史悠久，對于顳葉癲癇的輔助治療更具有較好的療效優勢[3]。本課題組長期的臨床實踐發現，柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的輔助治療具有良好的效果。近幾年的基礎實驗研究也表明，柴胡中含有的有效成分柴胡皂苷可以減低癲癇大鼠顳葉皮層、海馬區P-糖蛋白的表達，從而發揮抗癲癇作用[4]。鉤藤通過調控星形膠質細胞，可降低腦損傷早期的癲癇易感性，且具有神經保護作用[5]。但是，柴胡-鉤藤配伍的活性成分如何作用于顳葉癲癇的作用機制尚未有相關的研究和報道。

網絡藥理學融合了系統生物學、分子生物學、藥理學等多門學科，并以計算機網絡為平臺來預測藥物的作用靶點、從而提高藥物發現效率[6]。分子對接技術是指通過計算機軟件預測藥物小分子與靶點蛋白之間的結合模式和親和力[7]。因此，本研究借助網絡藥理學和分子對接技術，探討柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的作用機制，為柴胡-鉤藤配伍在神經系統疾病的應用奠定了良好的基礎。

1 資料與方法

1.1 顳葉癲癇相關靶點的收集

以“Temporal Lobe Epilepsy”為關鍵詞分別在GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)以及OMIM數據庫(https：//omim.org/search/advanced/)中檢索顳葉癲癇相關的靶點，并對數據進行整理去重。

1.2 中藥有效成分的查找

在TCMSP數據庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中分別檢索柴胡、鉤藤的成分，并以藥物篩選建議：口服生物利用度(OB)[8]≥30%，類藥性(DL)[9]≥0.18為過濾條件，分別篩選得到柴胡和鉤藤的有效成分。

1.3 中藥作用靶點的收集

將篩選出的柴胡和鉤藤的有效成分分別輸入TCMSP數據庫中，檢索獲得有效成分對應的靶點。把成分及靶點數據進行編排去重，導入到UniProt 數據庫中(https：//www.uniprot.org/)，對靶點蛋白進行基因注釋，獲得靶點對應的Gene symbol。

1.4 柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的靶點

將顳葉癲癇相關的靶點以及柴胡-鉤藤配伍的作用靶點共同導入到venny2.1.0在線軟件中(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行映射，得到柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的治療靶點。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網絡的構建

把篩選出的治療靶點輸入到STRING數據庫(https：//string-db.org/)中，構建蛋白-蛋白相互作用網絡(PPI網路)，以了解各個靶點蛋白之間是否存在著相互作用關系。

1.6 GO和KEGG富集分析

本研究中基因富集分析是基于R語言軟件(版本：v.3.5.0)條件下進行的，其軟件包clusterProfiler可以對基因集合或基因簇進行GO和KEGG富集分析和可視化[10]。將治療靶點導入R語言軟件中進行富集，并以P value<0.05且P.adjust<0.05為篩選條件，選取符合條件的前20的GO生物功能和KEGG通路。

1.7 “成分-靶點-通路-疾病”關系網絡的構建

對柴胡-鉤藤配伍的有效成分、顳葉癲癇的治療靶點、以及治療靶點富集前20條KEGG信號通路進行編排。并將編排的關系對文件導入到Cytoscape3.6.1軟件中進行可視化，構建“柴胡-鉤藤藥對有效成分-治療靶點-KEGG信號通路-顳葉癲癇”多維關系網絡，計算網絡中的節點連接度(degree值)。選取degree值最大的靶點，即柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的核心治療靶點。

1.8 分子對接預測

為了解柴胡-鉤藤藥對的有效成分與治療靶點的結合情況，本研究通過分子對接技術將柴胡-鉤藤的有效成分分別與核心治療靶點進行分子對接。同時以顳葉癲癇常用藥物卡馬西平、丙戊酸鈉、左乙拉西坦作為對照分析。首先在RSCB PDB數據庫中檢索獲得核心靶點蛋白的結構信息；在PubChem數據庫中查找獲得柴胡-鉤藤有效成分的結構信息以及卡馬西平、丙戊酸鈉、左乙拉西坦的結構信息；最后通過Autodock Vina實現小分子化合物與靶點蛋白的分子對接。

2 結果

2.1 顳葉癲癇相關的靶點

在GeneCards數據庫檢索獲得2 780個顳葉癲癇的靶點，在OMIM數據庫中查找得到553個顳葉癲癇靶點。對兩個數據庫的靶點信息進行合并，去除重復部分后共得到顳葉癲癇相關的靶點3 230個。

2.2 柴胡-鉤藤藥對有效成分及靶點

根據過濾條件：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18篩選出柴胡的有效成分17種，鉤藤的有效成分33種，共50種。根據藥物有效成分，在TCMSP中檢索共得到柴胡-鉤藤藥對有效成分作用的靶點200個。

2.3 柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的靶點

將顳葉癲癇相關的3 230個靶點以及柴胡-鉤藤藥對有效成分作用的200個靶點導入到venny中進行映射，得到柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的靶點共116個。對這116個治療靶點信息進行編排，結果表明：在柴胡-鉤藤藥對的50種有效成分中，能作用于這116個治療靶點的有效成分有41種，部分有效成分見表1。

表1 柴胡-鉤藤配伍作用于顳葉癲癇的部分有效成分基本信息

2.4 構建PPI網絡

把柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的116個靶點輸入STRING數據庫中，構建PPI網絡圖。結果表明：116個柴胡-鉤藤藥對作用于顳葉癲癇的治療靶點相互之間均存在直接或間接的作用關系，見圖1。其中PTGS2、MAPK1、AKT1、GASP3、VEGFA等治療靶點均在PPI網絡中發揮著至關重要的作用。

2.5 GO和KEGG分析

本研究基于R語言軟件中的clusterProfiler包對116個治療靶點進行GO和KEGG富集分析，并以P value<0.05且P.adjust<0.05為篩選條件，選取符合條件的前20的GO生物功能和KEGG通路。結果表明：治療靶點主要影響銨離子結合、兒茶酚胺結合、多巴胺結合、神經遞質受體的活動、多巴胺神經遞質受體活動、泛素樣蛋白連接酶結合、組蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性、激酶調節活動、細胞因子受體結合、泛素蛋白連接酶結合、核受體的活動、轉錄因子活性，直接配體調控序列特異性DNA結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、激活轉錄因子結合、神經遞質結合、蛋白結合、G蛋白偶聯胺受體活性、支架蛋白結合、整合素結合等生物學功能，見圖2；并且主要涉及糖尿病并發癥的年齡-憤怒信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、前列腺癌、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、結腸直腸癌、人類巨細胞病毒感染、內分泌的阻力、麻疹、胰腺癌、松弛素信號通路、多巴胺能神經突觸、膀胱癌、eb病毒感染、VEGF信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、丙型肝炎、肺結核等信號通路，見圖3。

注：灰度越深，圓形越大，則表明該靶點在PPI網絡中越重要。圖1 116個治療靶點的PPI關系網絡圖

注：橫坐標代表基因數，縱坐標代表GO條目，由上至下P值逐漸增大。圖2 GO 分析柱狀圖

2.6 構建“成分-靶點-通路-疾病”多維關系網絡

將柴胡-鉤藤藥對的41種有效成分、116個治療靶點以及治療靶點富集的前20條KEGG信號通路編排成關系對文件，導入Cytoscape軟件中進行可視化分析，得到“柴胡-鉤藤藥對有效成分-治療靶點-KEGG通路-顳葉癲癇”多維關系網絡，見圖4。計算網絡中各個治療靶點的Degree值(表2)。結果表明：柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇是通過多成分、多靶點、多通路共同起作用的。PTGS2是多維關系網絡中連接度最高的靶點，且它也是PPI網絡中的重要靶點。因此它可能是柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的核心靶點，在治療機制中發揮著重要的作用。

表2 柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的前30個靶點

2.7 分子對接預測

通過分子對接技術預測核心治療靶點PTGS2與柴胡-鉤藤藥對的41種有效成分的結合情況，計算出靶點蛋白與有效成分之間的結合能，見表3。若結合能<0 kJ/mol，表明有效成分小分子與靶點蛋白可以自發地結合，親合能<-5.0 kJ/mol，表明其結合性良好，結合能越小則分子間對接越好[11]。分子對接的結果表明：柴胡-鉤藤配伍藥對的41種有效成分均與核心治療靶點PTGS2的結合性良好，且97.56%的有效成分結合性優于左乙拉西坦和丙戊酸鈉。乙酸亞油醇酯與核心靶點的結合性較左乙拉西坦差，但與丙戊酸鈉相似。此外，有7.31%的有效成分與核心靶點的結合性優于卡馬西平，其余有效成分結合性均與卡馬西平相近。綜上，柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的療效顯著可能是由于其有效成分與顳葉癲癇的藥物靶點之間的結合性良好。

3 討論

顳葉癲癇屬于中醫“癇病”“癇證”的范疇，與風、痰、瘀、毒等病理因素密切相關[12]。早在《內經》有“諸風掉眩皆屬于肝，熱盛動風，風勝則動”，《三因極一病證方論》曰：“夫癲癇病，皆由驚動，使臟氣不平”;《醫方考》言：“癲疾者，風痰之故也……風熱盛于肝，則一身之筋牽掣，故令手足搐溺也”，均表明癇病的發病與肝氣疏泄失常密切相關。因此，中醫臨床上辨治癇病注重“從肝論治”[13-15]。常治以疏肝解郁、化痰熄風，如本課題組臨床上常使用的加味柴胡疏肝湯，方中柴胡功善疏肝解郁，鉤藤平肝熄風止痙之效佳，二者均歸肝經，配伍應用可增強治癇之力[16-19]。且既往基礎研究也證實了“從肝論治”復方加味柴胡疏肝湯的抗癲癇作用[20]。但是，加味柴胡疏肝湯中柴胡-鉤藤配伍抗癲癇作用機制尚未有相關的報道，因此本研究通過網絡藥理學及分子對接技術初步揭示柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的治療作用機制。

本研究通過網絡藥理學技術篩選出柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的有效成分有41種，治療靶點共116個；構建了“PPI網絡”和“柴胡-鉤藤藥對有效成分-治療靶點-KEGG通路-顳葉癲癇”多維關系網絡，篩選出核心治療靶點PTGS2。結果表明：柴胡-鉤藤配伍的同一種有效成分可作用于多個治療靶點，同一個治療靶點亦可對應多種有效成分；同一個治療靶點可參與多條信號通絡，同一條信號通路亦可富集多個治療靶點。因此，柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇是通過多成分、多靶點、多通路共同起作用的。116個治療靶點之間均有直接或間接的相互作用關系，而核心靶點PTGS2在“成分-靶點-通路-疾病”關系網絡和“PPI網絡”中均發揮著重要的作用，它可能在柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的機制中有著重要的意義。此外，本研究通過分子對接技術預測了核心治療靶點與柴胡-鉤藤配伍有效成分的結合性。結果表明：柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的療效顯著可能是由于其多種有效成分均與顳葉癲癇中的藥物靶點之間的結合性良好有關。

本研究篩選的核心治療靶點環氧合酶-2(PTGS2)是一種合成炎性介質前列腺素的酶，已被廣泛報道在癲癇發作過程中被誘導，被認為是癲癇治療的潛在神經治療靶點[21]。研究表明，PTGS2在顳葉癲癇的急性期和慢性期表達均顯著上調，而在潛伏期表達不明顯，通過靶向PTGS2阻斷前列腺素級聯反應已被認為是干預顳葉癲癇急性發作或癲癇持續狀態的一種方法[22-23]。癲癇發作后，包括白細胞介素、腫瘤壞死因子α(TNFα)、環氧合酶-2(PTGS2)等關鍵炎癥介質的表達明顯增加，可能導致腦內繼發性損傷，增加癲癇反復發作的可能性。在癲癇大腦特定區域PTGS2水平的升高有助于識別癲癇引起的腦部炎癥區域，因此，PTGS2抑制劑對顳葉癲癇、炎癥等神經系統疾病起到治療和干預作用[24]。綜上，PTGS2與顳葉癲癇的發病及治療密切相關。因此，PTGS2用于分子對接驗證靶點與藥物有效成分的結合情況具有一定的可靠性。

靶點功能分析結果表明，治療靶點共影響了157個GO生物功能；涉及157個KEGG信號通路。治療靶點主要影響的離子結合、兒茶酚胺結合、多巴胺結合、神經遞質受體的活動、多巴胺神經遞質受體活動、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、神經遞質結合、蛋白結合等生物學功能與文獻中報道相一致，均與癲癇及顳葉癲癇等的發生發展相關[25-29]。

治療靶點富集的KEGG信號通路中，與顳葉癲癇的發病相關的主要有IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、內分泌的阻力(Endocrine resistance)、多巴胺能神經突觸(Dopaminergic synapse)、VEGF信號通路等。顳葉癲癇的發病與炎癥反應密切相關，而炎性細胞因子血清白細胞介素、腫瘤壞死因子均是介導炎癥發生的重要參與因素[30-31]。研究證實在顳葉癲癇患者中，血清白細胞介素的水平明顯升高[25]。促炎性IL-17信號通路在藥物難治性癲癇免疫組學結構中起著主導的作用[32]。促炎因子IL-17具有增加血腦屏障的通透性和神經元興奮性的作用，其促炎作用可能與顳葉癲癇的發作有關。腫瘤壞死因子α(TNF-α)可以通過調節谷氨酸受體的運輸，增加興奮性突觸的傳遞，從而導致包括顳葉癲癇在內的癲癇發生率升高[33]。部分癲癇患者可伴有包括甲狀腺功能減退、生長減慢、體重異常、生殖和性功能障礙等在內的內分泌系統并發癥，這可能與內分泌阻力有關[34]。多巴胺能系統作為腦內重要的神經調節系統，對神經元興奮性有重要影響。研究發現顳葉癲癇患者存在著多巴胺介導的神經調節系統失衡，多巴胺在突觸中的持久性可能通過降低癲癇發作的閾值，從而導致癲癇更頻繁的發作[35]。血管內皮生長因子(VEGF)信號被證實是耐藥性顳葉癲癇的相關介質。VEGF信號介導的腦血管重塑可能參與癲癇腦內突觸神經傳遞的調節。此外，VEGF的產生及其受體在內皮細胞中的激活改變了血腦屏障的通透性，并可能加強神經元損傷和癲癇的發作[36-37]。綜上，本研究篩選的116個治療靶點中，其富集的主要生物學功能及信號通路與顳葉癲癇密切相關，且與文獻報道大致相同。

近年的臨床研究發現，對于使用卡馬西平治療無效的顳葉癲癇患者，添加左乙拉西坦可提高其療效，且優于添加丙戊酸鈉[38]。而卡馬西平聯合丙戊酸鈉治療顳葉癲癇可減輕藥物的不良反應[39]。因此，本研究選擇卡馬西平、左乙拉西坦、丙戊酸鈉作為對照藥物，進行分子對接。結果表明：柴胡-鉤藤配伍的41種有效成分均可與核心治療靶點PTGS2結合良好，除了乙酸亞油醇酯(Linoleyl acetate)外，其余有效成分與核心靶點的結合性均優于左乙拉西坦和丙戊酸鈉，且結合性優于卡馬西平的有效成分有3種。這可能是柴胡-鉤藤配伍聯合西藥治療顳葉癲癇療效顯著的重要原因。

本研究通過網絡藥理學技術，初步挖掘了柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的活性成分及成分作用的治療靶點、靶點的相互作用關系、GO生物學功能及KEGG信號通路；構建“成分-靶點-通路-疾病”多維關系網絡；揭示柴胡-鉤藤配伍輔助治療顳葉癲癇的作用機制。結果表明：柴胡-鉤藤配伍的有效成分可能通過多靶點、多途徑、多通路對顳葉癲癇起到治療作用。

本研究探討柴胡與鉤藤的配伍具有理論上的創新性，也進一步拓寬了柴胡-鉤藤配伍在臨床中的應用，為本課題組在柴胡-鉤藤配伍應用方面的深入研究奠定了良好的理論基礎。