復方梔子金花清熱瀉火藥理作用研究

孫延平，劉艷，劉源，劉宇萌，肖宗雨，趙東穎，楊炳友，匡海學

(黑龍江中醫藥大學 北藥基礎與應用研究教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及 天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

現代醫學認為“上火”是一種亞健康狀態，是受到氣候、飲食、情志、勞倦過度、不良生活習慣等因素的影響而產生的。近年來，出現“上火”狀態的患者數量呈增長勢態，如能及時進行調理，可迅速解除“上火”的狀態，使身體達到新的平衡。但若“上火”的狀態持續存在，就有可能進一步發展為臨床病癥[1]，在給生活帶來不便的同時也給身心造成一定的損害。復方梔子金花始載于《宣明論方》[2]，為經典的清熱瀉火復方，由梔子、黃連、黃芩、黃柏、大黃、金銀花、知母、天花粉等組成，用于肺胃熱盛，口舌生瘡，牙齦腫痛，目赤眩暈，咽喉腫痛等癥[3-4]。然而復方梔子金花是如何發揮清熱瀉火的作用機制目前仍不明晰。本研究采用拘束應激大鼠模型和小鼠耳腫脹模型，通過考察動物狀態、胸腺及脾臟指數，測定血清中ALT、TG、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8的含量，肝組織中MDA、NO、XOD的含量和ORAC及血清中總抗氧化能力T-AOC，明確梔子金花清熱瀉火的作用，并初步明晰其可能的作用機制，為其傳統功效提供現代藥理學的科學依據。

1 材料

1.1 實驗儀器

可見分光光度計(Thermo scientific公司)；酶標儀VICTOR X3型(PerkinElmer公司)；水浴鍋HHS型(上海博訊實業有限公司)；離心機(Micro公司)；旋轉蒸發儀(Buchi公司)。

1.2 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠,體質量(180±20)g和雄性KM小鼠,體質量(20±2)g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(黑)2015001。實驗室標準條件適應飼養1周后開始實驗。

1.3 實驗試劑與藥品

梔子(北京同仁堂，批號18100361)、黃連(北京同仁堂，批號18903340)、黃芩(北京同仁堂，批號17120071)、黃柏(北京同仁堂，批號18230012)、大黃(北京同仁堂，批號17330014)、金銀花(北京同仁堂，批號17070428)、知母(北京同仁堂，批號18100041)、天花粉 (北京同仁堂，批號17070026)，ALT、MDA、NO、XOD、ORAC、T-AOC、TG、SOD、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，生理鹽水 (哈爾濱三聯藥業股份有限公司)，20%脂肪乳劑 (四川科倫藥業股份有限公司)，冰醋酸 (天津市富宇精細化工有限公司)，二甲苯 (上海江萊生物科技有限公司)，阿司匹林 (南京白敬宇制藥有限責任公司)。

2 方法

2.1 對拘束應激大鼠模型的影響

2.1.1 藥品制備

復方梔子金花提取物的制備：根據2015版《中華人民共和國藥典》中梔子金花丸復方比例稱取各味藥，44倍量29%乙醇，回流提取3次，每次3 h，合并提取液，濃縮至無醇味，冷凍干燥即得。

2.1.2 造模與給藥

采用拘束應激大鼠模型模擬機體“上火”狀態[5]。拘束應激模型是以剝奪大鼠身體自由活動為模型，將大鼠置于拘束模型中，連續拘束21 d，每天拘束6 h(9:30—15:30)[6]。每天于造模前30 min給各組大鼠灌胃[7]。

將健康大鼠40只，隨機分成空白對照組，模型組，復方梔子金花低、中、高劑量組 (0.4 g/kg、0.8 g/kg、1.6 g/kg) 共5組，每組8只。空白對照組和模型組均予以同體積生理鹽水。

2.1.3 樣品的收集

大鼠按1 mL/100 g尾靜脈注射10%脂肪乳劑生理鹽水稀釋液，35 min后腹腔注射10%戊巴比妥鈉麻醉，沿腹中線用無菌剪刀剖腹，取出肝臟、胸腺和脾臟，腹主動脈取血，靜置1 h后離心 (5 000 r/min，5 min)，取上清液即血清備用。

2.1.4 考察指標

21 d后觀察大鼠體毛顏色、光澤度，精神狀態，體質量變化等。第22天對大鼠尾靜脈注射10%脂肪乳劑，35 min后麻醉，麻醉后取胸腺和脾臟稱重，按照公式：免疫器官指數=[免疫器官重量(g)/大鼠體質量(g)]×100%計算免疫器官指數[7]；取肝組織0.4 g，加入9倍體積生理鹽水，冰浴條件下研磨成10%勻漿，離心，按試劑盒法測定肝組織中過氧化脂質NO、MDA、XOD、ORAC含量；并腹主動脈取血，靜置1 h后離心 (5 000r/min，5 min)，取上清液按試劑盒法測定血清中ALT、TG、SOD、GSH-PX、IL-2、IL-3的含量及總抗氧化能力T-AOC[8]。

2.2 對二甲苯誘導的小鼠耳腫脹模型的影響

2.2.1 樣品制備 同2.1.1。

2.2.2 造模與給藥

小鼠連續灌胃給藥7 d后，末次給藥30 min后，除空白組外，每只小鼠右耳廓兩面涂抹濃度50 μL 100%二甲苯致炎，左耳對照[9-10]。將健康雄性KM小鼠48只，隨機分成空白組，模型組，阿司匹林陽性對照組 (0.75 g/kg)，復方梔子金花低劑量組(0.3 g/kg)、中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(1.2 g/kg)，共6組，每組8只?？瞻捉M和模型組均予以同體積的生理鹽水。

2.2.3 考察指標

致炎后30 min，將小鼠脫臼處死，剪下左右兩耳片，用6 mm直徑打孔器，分別在同一部位打下圓耳片，用電子天平稱兩耳片的重量，腫脹度為兩耳片的重量差，耳片腫脹率計算公式如下：腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%[11]；所得到的小鼠耳組織放入10%福爾馬林中固定，耳組織經脫水、包埋、切片、脫蠟、尹紅-蘇木精(HE)染色，封固后將標本置于顯微鏡下并選擇合適具有代表性的區域觀察拍照(20×)；致炎后1 h眼球取血，離心(3 000 r/min，5 min)，取上清液，按照試劑盒說明測試小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

2.3 統計學處理

3 結果

3.1 對拘束應激大鼠狀態的影響

與空白組相比，模型組大鼠精神萎靡，毛發凌亂、干枯毛躁，灌胃和束縛時反抗劇烈，且體質量增長緩慢。與模型組相比，復方梔子金花中、高各劑量組的大鼠精神狀態較好，體毛較整潔且光澤度好。

3.2 對拘束應激大鼠免疫器官指數的影響

與空白組相比，模型組大鼠的脾臟和胸腺出現萎縮，脾臟指數具有顯著性差異(P<0.05)，胸腺指數具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，梔子金花低、中、高劑量組可以顯著提高大鼠脾臟指數(P<0.05)；梔子金花高劑量組可以顯著提高大鼠胸腺指數(P<0.05)，結果見表1。

表1 梔子金花對拘束應激大鼠免疫器官指數的影響

3.3 對拘束應激大鼠肝組織中NO、MDA、XOD、ORAC含量和血清ALT、T-AOC、IL-2、IL-3和TG清除率含量的影響

與空白組相比，模型組大鼠肝組織中NO、MDA、XOD和血清ALT的含量、TG清除率明顯增高(P<0.01)，與模型組相比，梔子金花中、高劑量組可以極顯著降低大鼠肝組織中NO、MDA、XOD和血清ALT、TG的含量(P<0.01)；與空白組相比，模型組大鼠肝組織中ORAC和血清T-AOC、IL-2、IL-3降低，且具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，梔子金花中、高劑量組可以顯著提高ORAC、T-AOC、IL-2和IL-3(P<0.05)，結果見表2和3。

表2 梔子金花對拘束應激大鼠肝組織中NO、MDA、XOD、ORAC的影響

3.4 對小鼠耳腫脹度的影響

如表4所示，與空白組相比，模型組局部給予二甲苯后，小鼠的耳腫脹度具有極顯著差異(P<0.01)，表明造模成功；給藥后，與模型組比較，陽性藥組能夠明顯降低小鼠耳腫脹度，腫脹抑制率具有統計學意義(P<0.01)，復方梔子金花中、高劑量組能夠降低小鼠的耳腫脹度，且腫脹抑制率具有顯著性差異(P<0.05)。

3.5 對耳腫脹小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α的含量增高(P<0.05)，IL-1β、IL-6、IL-8的含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組能夠顯著降低小鼠血清中TNF-α、IL-8的含量(P<0.05)和IL-1β的含量(P<0.01)，梔子金花中、高劑量組能夠不同程度地降低小鼠血清中TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6的含量(P<0.01，P<0.05)，結果見表4。

表3 梔子金花對拘束應激大鼠血清中ATL、T-AOC、IL-2、IL-3、TG的影響

表4 復方梔子金花對二甲苯誘導小鼠耳腫脹度的影響

3.6 對小鼠腫脹耳組織形態學的影響

蘇木精和伊紅對小鼠耳組織染色(HE)，觀察各組小鼠耳組織的炎癥水腫和淋巴細胞浸潤程度。如圖1中HE染色結果所示，與正常組小鼠耳組織相比(圖1a)，給予二甲苯刺激的小鼠耳組織有明顯的水腫、充血、肌肉松散和淋巴細胞浸潤現象(圖1b)。與模型組相比，陽性藥組、復方梔子金花低、中、高劑量組(圖1c～f)能夠改善小鼠耳組織的水腫和淋巴細胞浸潤現象。

注:a,正常組;b,模型組;c,陽性藥組;d,低劑量組;e,中劑量組;f,高劑量組。圖1 二甲苯誘導的小鼠耳組織的HE染色(×400)

4 討論

“上火”是一種應激性生理反應，是機體受到應激因素刺激引起的一種穩定及維持機體內環境的適應能力，從“上火”到形成疾病是一種包含中樞、內分泌及免疫系統的應激負荷反應過程。當機體處于應激負荷時，體內活性氧自由基生成增加，破壞脂肪酸鏈和細胞膜完整性，使胞漿內ALT滲出[12]，過量生成的NO可以與超氧陰離子直接或間接作用產生過氧化亞硝酸鹽，導致脂質過氧化，生成脂質過氧化產物MDA。同時，當機體受到外界刺激，巨噬細胞便會釋放出多種與炎癥和免疫應答密切相關的細胞因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等[13]。本實驗首次采用拘束應激大鼠模型和二甲苯誘導的小鼠耳腫脹模型，考察復方梔子金花清熱瀉火功效的藥理學作用及其作用機制。實驗結果顯示，復方梔子金花可以明顯抑制拘束應激所致的免疫器官指數的降低，降低拘束應激大鼠ALT、NO、MDA的含量，顯著提高其T-AOC、ORAC指數、TG清除率、GSH-PX活力和IL-2含量，改善二甲苯誘導的小鼠耳腫脹度，顯著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

綜上所述，復方梔子金花發揮清熱瀉火的藥理作用機制可能是與改善脂代謝紊亂、緩解氧化應激狀態以及降低炎癥反應等相關。該研究不僅為復方梔子金花的作用機制、藥效物質基礎、質量評價等進一步研究提供了理論依據，也為“上火”相關發生機制的深入研究奠定了實驗基礎。