凍融輔助堿提法提取蛹蟲草蛋白的條件優化

蔣 益 鄭惠華 劉廣建* 薛 璟 季宏更 張 辰 張 蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）別名北冬蟲夏草、北蟲草，與冬蟲夏草同屬異種[1]。野生的蛹蟲草分布范圍廣，但數量稀少，十分珍貴。人工培育的蛹蟲草化學成分與野生冬蟲夏草相似，目前已被衛健委藥食兩用名單收入。研究表明蛹蟲草蛋白含量豐富，其中必需氨基酸的種類齊全，比例適宜，同時含有多糖、核苷、甾醇等多種功效成分[2-3]。

食用菌的蛋白質量分數一般為干重的20%~40%，高于大多數食品，且氨基酸組成平衡合理，比植物蛋白更全（植物性蛋白常缺少1種或2種必需氨基酸），比動物蛋白安全（動物蛋白常含大量脂肪和膽固醇），還含有一些稀有氨基酸。但目前對食用菌蛋白的研究仍然較少，市場上很少見到以食用菌蛋白為主原料的產品。蛹蟲草的粗蛋白質量分數約為30%，氨基酸的種類齊全，營養價值高，是優質的新型蛋白質資源。當前蛹蟲草深加工產品主要是蟲草素、多糖、腺苷等活性成分。研究考察了凍融輔助堿提法中各因素對蛹蟲草蛋白提取率的影響，并對所提取蛋白的氨基酸組成進行了分析，以期為食藥用菌類蛋白質的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）供試原料：蛹蟲草子實體超微粉（300目）由江蘇省蘇微微生物研究公司提供（粗蛋白質量分數為30.18%）。

（2）試劑：牛血清白蛋白，國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250、濃鹽酸、H3BO3、NaOH等，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

pH計（PB-10），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；冷凍干燥機（FD-1-80），北京博醫康實驗儀器有限公司；冷凍離心機（GL-21M），湘儀離心機儀器有限公司；凱氏定氮儀（KjeltecTM 8100），福斯分析儀器公司；紫外可見分光光度計（Alpha-1500），上海譜元儀器有限公司；氨基酸分析儀（L-8900），日本日立有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛹蟲草蛋白堿提工藝流程

蛹蟲草粉→單因素處理→9 000 r／min離心15 min→上清液調pH至等電點酸沉→9 000 r／min離心15 min，中和→冷凍干燥→粗蛋白提取物

1.3.2 堿提單因素試驗

固定基礎提取條件：pH為11、提取溫度為30℃、料（g）液（mL）比為1∶20、提取時間為2 h。分別進行pH、提取溫度、提取時間、料液比單因素試驗，以確定后續試驗的因素與水平。

1.3.3 反復凍融單因素試驗

稱取一定量的蛹蟲草粉，按料（g）液（mL）比1∶20加水，調pH為11，分別置于-20℃低溫冰箱與-80℃超低溫冰箱中完全凍結后取出于室溫解凍，此為凍融1次，如此凍融1次、2次、3次、4次后將液體按1.3.2中的基礎條件提取蛋白，以不經凍融為對照，確定最佳凍融數。

1.3.4 正交優化設計

根據單因素試驗結果，以蛋白提取率為考察指標，設計L9（34）正交試驗表，對提取工藝參數進行優化。

1.3.5 蛋白提取率的測定

提取液中蛋白含量的測定采用Bradford法[4]，蛹蟲草粉樣品的蛋白含量測定參照國標GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法[5]。根據以下公式計算提取率：

1.3.6 蛹蟲草蛋白等電點（pI）的測定

等電點的測定參照劉廣建等[6]的方法。

1.3.7 氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[7]中方法。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH對蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖1可知，在pH低于12時，蛹蟲草蛋白提取率隨pH的上升而升高，其中pH 10~12時，提取率上升趨勢明顯，在pH 12時提取率最高，為32.85%，之后蛋白的提取率有所下降。說明蛹蟲草蛋白質大部分是堿溶性蛋白，pH上升使得更多的蛋白質溶出；同時堿液還能破壞蛋白質分子的次級鍵尤其是氫鍵，并使某些極性基團發生解離，使蛋白質表面分子帶有相同的電荷，促進了蛋白質的溶出[8]。考慮pH高于12，會引起蛋白質變性，因此選取pH 11、11.5、12進行后續正交試驗。

圖1 pH對蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.1.2 提取溫度對蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖2可見，提取溫度為20℃時，蛹蟲草蛋白提取率較低，僅為15.55%，溫度為20~40℃時，蛋白提取率上升趨勢明顯；溫度為40~50℃時，提取率升幅減緩，溫度為50℃時，提取率最高，為27.58%；溫度高于50~70℃時，提取率幾乎無變化。可見在一定提取溫度范圍內，溫度的升高會促進蛋白質的溶出。因提取溫度為40℃、50℃時，蛋白提取率變幅不大，從節省能耗考慮，選取35、40、45℃，進行之后的正交試驗。

圖2 提取溫度對蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.1.3 提取時間對蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖3可見，隨著提取時間的延長，蛹蟲草蛋白提取率先上升后趨穩。提取時間為1 h時，提取率非常低，說明提取時間太短，料液無法充分作用，蛋白質不易溶出；提取時間在1~3 h，隨著提取時間的延長，蛋白提取率快速上升，提取時間3 h時，提取率為25.44%。考慮提取時間因素的結果已非常明顯，因此固定提取時間為3 h，不將提取時間作為正交優化試驗因素。

圖3 提取時間對蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.1.4 料液比對蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖4可知，當料（g）液（mL）比為1∶10時，蛹蟲草蛋白提取率僅有9.76%，之后隨著料液比的上升，蛋白提取率明顯上升；但料液比大于1∶25后，蛋白提取率幾乎不變。故選用料液比1∶20，1∶25、1∶30這3個水平進行后續正交試驗。

2.1.5 反復凍融對蛹蟲草蛋白提取率的影響

凍融法主要是利用冷凍過程中形成的胞內冰晶在融化時使細胞膨脹而破壁，反復多次從而使得目的產物更多的溶出，屬物理破壁技術，操作簡便且不破壞有效成分[9]。由圖5可知，-20℃低溫組與-80℃超低溫組的蛹蟲草蛋白提取率都比未經凍融有所上升，兩種冷凍溫度相同凍融次數的蛋白提取率差異不明顯；凍融次數的增加，兩種冷凍溫度的蛋白提取率都逐步上升，凍融3次、4次時提取率最高，為25%左右，但兩種冷凍溫度相同凍融次數，蛋白提取率差異很小。基于簡化操作和節能考慮，選擇-20℃凍融2次、3次、4次進行后續正交試驗。

圖4 料液比對蛹蟲草蛋白提取率的影響

圖5 凍融次數對蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.2 凍融輔助堿提法正交優化結果

在單因素試驗的基礎上，選擇料液比、pH、凍融次數、提取溫度進行四因素三水平正交試驗（表1、表2）。

表1 L 9（34）正交試驗因素水平

由表2可知，B（pH）因素對蛹蟲草蛋白提取率影響最大（R值最高）。各因素對蛹蟲草蛋白提取率影響依序為B>A>D>C（即pH>料液比>溫度>凍融次數），最佳組合為A3B3C2D2，即最適條件為料（g）液（mL）比1∶25，pH 12，凍融3次，提取溫度40℃。因此，試驗凍融輔助堿提法提取蛹蟲草蛋白的最佳條件為料（g）液（mL）比1∶25，-20℃反復凍融3次，pH 12，提取溫度40℃，提取時間3 h。驗證試驗，此條件蛹蟲草蛋白提取率為35.34%。

表2 L 9（34）正交試驗結果

2.3 蛹蟲草蛋白等電點

實際試驗過程中，pH很難調節到正好預設的點，而過多的酸堿調節會影響待測液體體積從而影響各pH下吸光值的比較，因此操作中盡量調到接近即可。由圖6可知，當pH為3.50左右時，上清液吸光值最低，說明此時液體中殘存蛋白最少，故pH 3.50為蛹蟲草蛋白的等電點。此pH條件下，4℃沉淀過夜，按最佳條件提取的蛋白離心后調節pH至中性，經冷凍干燥后得到粗蛋白質量分數為47%的蛹蟲草蛋白粉。

圖6 蛹蟲草蛋白等電點

2.4 蛹蟲草蛋白氨基酸組成

蛹蟲草蛋白氨基酸測定結果見表3。

由表3可知，試驗所提蛹蟲草蛋白富含17種氨基酸，其中質量分數前三的氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸，分別為6.18%、5.58%、4.02%，與朱麗娜等測定的蛹蟲草氨基酸組成結果一致[2]。因采用酸水解制樣，酸水解會破壞色氨酸，因此色氨酸未能檢測到，而其他必需氨基酸種類齊全，且必需氨基酸占氨基酸總量的42.60%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白質E/T應達40%的標準[10]。部分氨基酸評分（AAS）不高是由于此蛋白質還僅是粗提物，有待于進一步地去雜提純。

表3 蛹蟲草蛋白的氨基酸組成及質量分數

3 小結與討論

通過單因素試驗得到凍融輔助堿提蛹蟲草蛋白的最優條件，并在此基礎上優化結果：蛋白提取料（g）液（mL）比1∶25，-20℃反復凍融3次，pH 12，提取溫度40℃，提取時間3 h，蛹蟲草蛋白提取率為35.34%。

氨基酸組成測定結果，蛹蟲草蛋白氨基酸種類齊全，必需氨基酸占氨基酸總量的42.60%，具有較好的營養價值。其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量豐富，三者均屬于呈味氨基酸，這一結果與菇類鮮美的風味相符。谷氨酸參與神經元的發育，突觸的形成、維持和可塑性變化，影響學習與記憶等高級認知功能[11]。天冬氨酸能改善心肌收縮功能，減少耗氧量，在冠狀動脈循環障礙缺氧時，保護心肌；同時也參與鳥氨酸循環，能促進氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞[12]。亮氨酸可通過促進胰島素分泌來降低機體的血糖含量，對高原記憶損傷有改善作用[13-14]。可見蛹蟲草蛋白還具有一定的保健價值，是一種優質蛋白，可作為一種新型的蛋白資源應用于健康食品的研制與開發。