基于TCGA構建胃癌免疫基因預后風險評估模型

王永強 彭際奎 姜洪偉 王舉

內蒙古自治區人民醫院胃腸外科，呼和浩特 010017

胃癌是嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，我國胃癌發病率高，在男性、女性分別居惡性腫瘤第2、第3位，病死率均居惡性腫瘤第2位［1］。早期胃癌，手術治療能有效控制疾病的惡化。然而，胃癌發病隱匿，早期癥狀不明顯，就診時大多屬晚期，已出現腹膜、肝、肺等遠處轉移，失去手術機會。另外，雖然化療聯合靶向治療是晚期胃癌或胃癌術后的主要手段，但受耐藥的影響，其療效有限［2-3］。數據顯示，胃癌5年生存率僅為31.5%［4］。因此，探索胃癌發生發展新機制以及制定治療新策略迫在眉睫。近年來，胃癌腫瘤微環境免疫抑制狀態以及胃癌對免疫治療響應的研究備受關注。

目前認為，免疫微環境影響腫瘤發生、發展、轉移及耐藥［5-6］，腫瘤浸潤淋巴細胞可用來評估腫瘤患者復發及死亡風險［7-8］。研究表明微衛星不穩定的胃癌患者接受抗PD-1/PD-L1單抗的免疫治療可獲得明顯的生存受益［9-10］。另外，對于腫瘤微環境中效應T細胞浸潤增多、腫瘤突變負荷高的患者，臨床預后也更佳［11-12］。然而，受限于免疫細胞標志物，傳統檢測免疫浸潤的方法，例如流式細胞計數、免疫組化法等，并不能全面反應免疫細胞的浸潤情況。利用轉錄組數據，通過單樣本基因集富集分析，可充分展示腫瘤患者28種免疫細胞浸潤特征，從而指導臨床實踐。對于胃癌，目前還沒有基于免疫基因數據庫分析其免疫微環境以及評估其預后的分子模型。因此，本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫獲取大樣本的胃癌轉錄數據，以期構建胃癌免疫相關生存模型，并探索免疫微環境生存相關性以及其影響胃癌發生發展的重要調控通路。

1 材料與方法

1.1 原始數據下載及數據預處理 從TCGA官網（https：//portal.gdc.cancer.gov/repository）下載胃癌測序數據，依次選擇STAD→RNA-Seq→FPKM，并整理成行名為基因名、列名為樣本名的矩陣文件。免疫相關基因列表從ImmPort網站（https.//www.immport.org/home）下載并整理，總共1 739個免疫基因。從總矩陣中提取免疫相關基因表達量，用于后續分析。此外，從TCGA網站下載胃癌臨床數據，整理成矩陣文件，并排除：（1）臨床信息不完整的病例；（2）術后隨訪時間小于90 d的病例。

1.2 構建風險預測模型

1.2.1 分組 將免疫相關基因、臨床預后矩陣合并成行名為樣本名，列名為生存時間、生存狀態和基因的新矩陣，采用R“caret”包，按6∶4比例分為訓練集、驗證集，并采用卡方檢驗分析兩組樣本集臨床病理特征的差異性。

1.2.2 構建風險評估模型 首先采用單因素Cox分析在訓練集中篩選預后相關免疫基因，在此基礎上，利用多因素Cox分析，得到胃癌風險評估模型。進一步利用模型對樣本進行評分，以中位風險評分將樣本分為高、低風險組，運用R“survminer”包繪制高、低風險Kaplan-Meier生存曲線從而分析該模型預測效果；運用R“survival ROC”包繪制受試者工作特征曲線（ROC）從而驗證分析模型可靠性；再運用以R“pheatmap”包繪制風險狀態圖。

1.2.3 驗證風險評估模型 利用上述風險模型對驗證集樣本進行評分，并以測試集中位風險評分將驗證集樣本分為高、低風險組，再分別運用R“survminer”“survival ROC”及“pheatmap”包繪圖，進一步驗證模型預測的有效性及可靠性。

1.3 Cox回歸分析篩選影響胃癌預后的獨立危險因素 將臨床病理特征及生存矩陣、風險評分（risk score）矩陣整理合并成包含生存時間、生存狀態、性別、年齡、分化程度、TNM分期以及風險評分的新矩陣。先采用單因素Cox分析，篩選預后相關變量，再預后相關的變量納入多因素Cox回歸分析，最終篩選影響胃癌預后的獨立危險因素。

1.4 免疫細胞浸潤分析 利用單樣本富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA），將基因表達矩陣轉化成28種免疫細胞相對浸潤比例矩陣，行名是免疫細胞類型，列名是樣本名。預設特征基因集，即各免疫細胞的特征基因集，從最近發表的2篇文獻整理［13-14］。卡方檢驗分析高、低風險組與各免疫細胞浸潤比例、各臨床病理特征的關系，采用R“pheatmap”包繪制高、低風險熱圖。

1.5 高、低風險組差異分析 運用R“edger”包分析高、低風險組差異表達基因后，再利用R“clusterProfiler”對差異基因進行基因本體論（GO）、京都基因與基因組大百科全書數據庫（KEGG）富集分析，以探索影響胃癌預后的重要調控通路以及相關分子機制。

1.6 統計學分析 采用R語言對本研究進行統計學分析，采用survival包進行單因素、多因素Cox回歸分析。計數資料采用χ2檢驗，以R“chisq.test”函數分析。計量資料采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，以R“t.test”或“wilcox.test”函數分析。

2 結 果

2.1 分組 按照排除標準，將胃癌樣本分為訓練集（221例）、驗證集（147例），χ2檢驗結果顯示，訓練集、驗證集樣本在年齡、性別、病理分級、臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移方面差異均無統計學意義（均P＞0.05），說明兩組樣本具有可比性，見表1。

2.2 Cox比例風險回歸模型分析結果 采用單因素Cox分析在訓練集中篩選預后相關免疫基因（P＜0.05），再納入多因素Cox分析，得到由9個免疫基因構成的胃癌預后風險評估模型（圖1），風險值（risk score）=PROC×0.076+IGKV1D-43×0.032+CLCF1×0.049+IL21RA×-0.074+TAFA4×0.061+NOX4×0.446+INHA×0.133+ITGAV×0.025+FABP3×0.019，按訓練集中位風險值分別將訓練集、驗證集樣本分為高、低風險組。

2.3 Kaplan-Meier生存及ROC分析 采用R“survminer”包對高、低風險組進行Kaplan-Meier分析，檢測風險評估模型預測胃癌患者預后的有效性，結果顯示，訓練集中高、低風險組5年總生存率（OS）分別為20.0%（22/110）、50.5%（55/111）；驗證集中高、低風險組5年OS分別為24.7%（18/73）、43.2%（32/74）（圖2A、B）；兩組樣本集高風險組OS均顯著低于低風險組（均P＜0.05）。采用R“time ROC”包進行ROC繪制，檢測風險評估模型預測胃癌患者預后的可靠性，結果顯示，訓練集1、3、5年ROC的AUC值為0.69、0.71、0.78，驗證集1、3、5年ROC曲線的AUC為0.56、0.71、0.78（圖2C、D）。

圖2 訓練集、測試集胃癌患者中高、低風險組Kaplan-Meier生存曲線及ROC（A為訓練集的生存曲線，B為驗證集的生存曲線，C為訓練集的ROC，D為驗證集的ROC）

2.4 免疫風險評估模型Cox回歸分析 以構建的免疫風險評估模型聯合胃癌臨床病理特征，包括性別、年齡、分化程度、TNM分期，先做Cox單因素分析，再納入預后相關的因素做Cox多因素分析，篩選影響胃癌預后的獨立因素，結果顯示，在訓練集、驗證集中免疫風險評估模型、TNM分期都是影響胃癌預后的獨立因素（表2）。

2.5 免疫風險評估模型與免疫細胞浸潤、臨床病理特征的關系 利用Cibersort反卷積算法，將每個樣本基因表達矩陣轉化成28種免疫細胞浸潤比例的矩陣，并采用χ2檢驗分析訓練集、驗證集中高、低風險組與臨床病理特征的關系，采用Wilcoxon秩和檢驗（屬于非參數檢驗）分析訓練集、驗證集中高、低風險組與免疫細胞浸潤的關系。結果如圖3所示，訓練集、驗證集中免疫風險評分均與活化的CD4+T細胞的浸潤有關，高風險組活化CD4+T細胞的浸潤比例顯著降低（P＜0.05）。

表1 訓練集、測試集胃癌患者的臨床病理特征分布（例）

表2 胃癌臨床病理特征及風險預測模型在訓練集、測試集的單因素及多因素Cox回歸分析

2.6 風險差異基因GO、KEGG富集分析 利用非參數檢驗，分別在訓練集、驗證集中，篩選高、低風險組差異基因，再以R“clusterProfiler”包對差異基因進行KEGG富集分析，以初步探索模型中基因促進胃癌進展的分子機制。如圖4所示，訓練集、驗證集的差異基因均富集于PI3K-Akt、cGMP-PKG、ECM-受體結合、黏著斑激酶、腫瘤蛋白多糖等腫瘤相關信號通路。

3 討 論

作為構成腫瘤微環境的重要組成部分，免疫細胞在腫瘤發生、轉移、耐藥、預后評估、治療評估等方面起重要作用。免疫評分已作為胃腸道腫瘤預后判斷的重要依據。本研究基于TCGA數據庫，利用Cox比例回歸模型，構建了由9個免疫基因組成的胃癌預測模型，利用該模型可準確、有效地評價胃癌預后。

利用公共數據庫如TCGA、GEO測序或芯片、臨床數據構建胃癌預后模型的研究較多，包括利用編碼蛋白基因、lncRNA、miRNA構建模型。此類預測模型存在以下問題：（1）為減少納入構建模型的基因數，先設定嚴格閾值，篩選差異表達基因。然而，預后相關基因不一定是差異基因。因此，一些關鍵基因可能被剔除。隨著生物信息學發展，功能基因被進一步注釋、分類，如免疫、代謝以及RNA結合蛋白相關基因。（2）利用全部樣本構建模型，缺少外部和/或內部數據的交叉驗證，模型的可靠性有待商榷。鑒于以上問題，本研究納入全部免疫相關基因（1 739例）建模，而不篩選差異基因；TCGA胃癌樣本分為訓練集、驗證集，在訓練集中建模，在驗證集中檢測，設置循環，滿足條件后輸出結果。本研究構建的模型在訓練集、驗證集中均能有效評估胃癌患者預后，隨訪時間越長，準確性越高，且該模型是胃癌預后的獨立危險因素。高風險組患者活化CD4+T細胞浸潤比例減少，CD4+T細胞浸潤是影響結腸癌預后的獨立危險因素，部分解釋了該組患者預后差的原因［15］。此外，本研究分別在訓練集、驗證集中篩選高、低風險組差異基因，納入GO、KEGG富集分析以初步探索模型基因導致患者預后差的分子機制，結果顯示模型基因可能通過激活PI3K-Akt通路促進胃癌轉移、耐藥。有文獻報道，PI3K-Akt參與胃癌轉移及化療耐藥［16-17］。

圖3 訓練集、驗證集胃癌患者高低風險組臨床及免疫細胞浸潤熱圖（A為訓練集，221例，B為驗證集，147例）

圖4 訓練集、驗證集胃癌患者風險差異基因KEGG富集圖（A為訓練集，B為驗證集）

該胃癌預后評估模型包含8個風險基因PROC、IGKV1D-43、CLCF1、TAFA4、NOX4、INHA、ITGAV、FABP3和1個保護基因IL27RA，其中4個風險基因被報道與胃癌或其他惡性腫瘤發生、發展及預后相關。心肌營養因子樣細胞因子1（CLCF1）屬于Gp130細胞因子家族成員，與細胞因子受體因子1（CRLF1）形成異源二聚體，與神經營養因子（CNTF）競爭性結合其受體CNTFR，從而激活JAK-STAT增殖相關信號通路，與肝細胞癌索拉菲尼耐藥、有氧糖酵解有關［18］。另外，腫瘤相關巨噬細胞通過CLCF1/CXCL6/TGF-β軸協調肝癌細胞與中性粒細胞的“對話”［19］。目前尚無CLCF1與胃癌發生、轉移、預后及耐藥的報道。本研究提示CLCF1是影響胃癌預后的危險因素，CLCF1高表達的患者預后差，然而，CLCF1促進胃癌進展的作用及機制需要進一步研究。NAPDH氧化酶4（NOX4）作為催化亞基，可促進活性氧（ROS）的產生，而ROS伴隨腫瘤代謝重編程產生，可作為第二信使，參與多條信號通路的激活及氧化還原信號調控與腫瘤代謝。沉默NOX4或使用抑制劑可逆轉由腫瘤相關成纖維細胞引起的CD8+T細胞耗竭而出現的免疫抑制狀態，從而改善免疫治療耐藥情況［20］。本研究顯示，NOX4在模型中所占權重最高，高表達個體罹患胃癌的風險增高1.56倍，說明NOX在胃癌預后評估中的作用最大。整合素α5（integrinαV，ITGAV）屬于整合素家族成員之一，與整合素β亞基形成異源二聚體，調節新生血管生成及腫瘤發展。細胞外基質通過ITGAV激活JAK2/STAT5通路，而該通路參與細胞干性維持及腫瘤發生，IL-32γ通過抑制ITGAV介導的STAT5通路從而抑制肺癌干細胞的增殖［21］。作為轉錄調控因子YAP、WWTR1靶基因的ITGAV不僅直接激活Hippo通路，促進肝癌轉移，而且正反饋調節YAP、WWTR1的活性。而且，有文獻報道，ITGAV促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的能力［22］。本研究發現，ITGAV高表達個體預后差，提示ITGAV可能促進胃癌的轉移從而影響預后。脂肪酸結合蛋白3（fatty acid binding protein 3，FABP3），在脂肪酸轉運、細胞增殖以及基因調控方面起重要作用，其高表達被認為是非小細胞肺癌的不良預后因素［23］，與本研究顯示的FABP3高表達是胃癌不良預后因素相似。

綜上所述，本研究利用TCGA胃癌轉錄組數據，構建了由9個免疫基因組成的預后評估模型，訓練集、驗證集驗證結果進一步證實了該模型具有良好的預測性能，其能準確區分高、低風險的病例，具有潛在臨床應用價值。