3,4-二甲氧基-4′-氯聯芐的合成及其抑制HepG2細胞己糖激酶2活性研究

關 麗,趙惠茹,李偉澤*,趙 寧,胡詩寒，劉保林,馮 鋒

(1.西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021；2.中國藥科大學中藥學院,江蘇 南京 211198)

肝癌為我國常見惡性腫瘤之一，年死亡率居腫瘤死亡率的第二位。瓦伯格效應(Warburg Effect)指出，正常細胞能量代謝以氧化磷酸化為主，而腫瘤細胞能量以有氧糖酵解為主[1]。根據瓦伯格效應，抑制腫瘤細胞有氧糖酵解能量代謝可能是癌癥治療的有效策略[2-3]。己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)是有氧糖酵解的第一個關鍵限速酶，主要負責葡萄糖的磷酸化[4]。活性HK2分布在線粒體上以保持線粒體內膜的完整性[5]，防止內膜釋放凋亡因子[6]。當藥物使HK2從線粒體上脫落時，線粒體膜電位迅速上升，凋亡因子釋放，從而誘導凋亡[7]。

石斛為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)植物，杓唇石斛素(moscatilin)是石斛中的代表性聯芐類化合物，具有明顯的抗腫瘤活性[8-12]。前期研究表明，杓唇石斛素衍生物3,4-二甲氧基-4′-氯聯芐(Bd)對HepG2細胞毒性最強。

作者以3,4-二甲氧基苯甲醛(Ⅰ)為原料，通過NaBH4還原醛基、羥基氯代、與三苯基膦反應合成膦葉立德中間體(Ⅳ)，化合物Ⅳ與4-氯苯甲醛縮合得到二苯乙烯衍生物Ⅴ，再經過催化氫化反應合成Bd，合成路線見圖1。采用激光共聚焦免疫熒光實驗研究Bd對HepG2細胞HK2活性的影響，探討其抗肝癌的可能機制。

a)NaBH4,EtOH,0 ℃,rt,1 h;b)SOCl2,Et3N,DCM,0 ℃,rt,3 h;c)PPh3,toluene,reflux,6 h;d)4-chlorobenzaldehyde,NaH,

1 實驗

1.1 試劑與儀器

合成實驗所用化學試劑，阿拉丁；二甲基亞砜(DMSO)，國藥集團化學試劑有限公司；HepG2細胞，中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；己糖激酶2抗體，Abcam；DAPI染色液、線粒體紅色熒光染料和FITC標記的山羊抗兔二抗、抗猝滅劑，碧云天生物技術有限公司；柱層析硅膠，上海譜振生物科技有限公司。

Avance 300 MHz型NMR核磁共振儀，Bruker；1100 Series型ESI-MS質譜儀，美國Agilent；GF254型硅膠薄層預制板，青島海洋化工廠；二氧化碳培養箱，Thermo；TR6000型全自動酶標儀，深圳雷杜；LSM 710型激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss。

1.2 3,4-二甲氧基-4′-氯聯芐(Bd)的合成

1.2.1 3,4-二甲氧基苯乙醇(Ⅱ)的合成

將化合物Ⅰ(10.0 g,0.060 mol) 溶于50 mL EtOH中，冰浴條件下緩慢加入NaBH4(0.84 g,0.022 mol)，室溫攪拌1 h，TLC監測反應完全；然后加入5%鹽酸調節pH值至7；減壓濃縮后，殘渣用二氯甲烷萃取(10 mL×3)，合并有機層，用無水Na2SO4干燥，過濾，濾液濃縮得淡黃色油狀化合物Ⅱ9.94 g，產率98.3%。

1.2.2 4-氯甲基-1,2-二甲氧基苯(Ⅲ)的合成

將化合物Ⅱ(9.0 g,0.054 mol) 溶于二氯甲烷(50 mL)中，冰浴下加入三乙胺(7.7 mL,0.055 mol)，再緩慢滴加二氯亞砜(4.3 mL,0.05 mol)，室溫攪拌3 h；溶液用蒸餾水洗滌(10 mL×3)，合并有機層，用無水Na2SO4干燥，過濾，濾液濃縮得亮黃色油狀化合物Ⅲ8.57 g，產率85.8%。

1.2.3 (3,4-二甲氧基芐基)三苯基氯化膦(Ⅳ)的合成

將化合物Ⅲ(8.0 g,0.043 mol) 和三苯基膦(11.4 g,0.043 mol)同時溶解于少量甲苯(20 mL)中，加熱回流6 h，有大量白色固體析出；冷卻至室溫后，抽濾，紅外燈烘干得白色粉末化合物Ⅳ10.6 g，產率92.3%，m.p.148～151 ℃。

1.2.4 3,4-二甲氧基-4′-氯聯芐(Bd)的合成

將化合物Ⅳ(2.0 g,4.454 mmol)和4-氯苯甲醛(0.624 g,4.454 mmol)同時溶解在少量干燥的四氫呋喃(10 mL)中，氬氣保護，冰浴條件下緩慢加入NaH(0.116 g,4.833 mmol)，加畢，室溫反應過夜；濃縮反應液，得到順反混合的二苯乙烯衍生物，減壓濃縮，溶于10 mL甲醇，加入一小勺10% Pd/C催化氫化反應48 h，得到Bd粗品。經硅膠柱色譜(展開劑：石油醚-丙酮，10∶1)純化得淡黃色油狀化合物Bd，產率61.4%。

1.3 激光共聚焦免疫熒光實驗[13]

HepG2細胞消化、計數，配制成濃度為5×104個·mL-1的細胞懸液，置于6孔板進行細胞爬片，然后置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養12 h；棄去培養基，細胞爬片成功后給藥，設置化合物Bd(0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1)組和空白組培養48 h；PBS清洗2次后，用線粒體紅色熒光染料進行線粒體染色20 min；用含3%BSA的PBS封閉細胞2 h，再用己糖激酶2抗體(HK2 antibody)于4 ℃下一起孵育過夜；PBS清洗細胞后，用FITC標記的山羊抗兔二抗染色2 h；PBS清洗細胞3次，每次5 min，并用DAPI染色20 min；PBS清洗細胞3次，每次5 min，加抗猝滅劑在激光共聚焦顯微鏡下拍片。

2 結果與討論

2.1 中間體和目標產物的表征

3,4-二甲氧基苯乙醇(Ⅱ)：1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：6.97(1H，d，J=1.8 Hz，H-2),6.87(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.70(1H,dd,J=1.8 Hz、8.1 Hz,H-6),4.61(2H,s,Ar-CH2-),3.83(3H,s,-OCH3),3.75(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：150.1,148.7,121.4,117.7,114.2,112.6,65.1,56.1,56.0;ESI-MS,m/z:169.1[M+H]+。

4-氯甲基-1,2-二甲氧基苯(Ⅲ)：1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：6.97(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.95(1H,dd,J=1.8 Hz、8.1 Hz,H-6),6.86(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.64(2H,s,Ar-CH2-),3.83(3H,s,-OCH3),3.74(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：150.0,149.6,131.1,121.9,113.7,112.6,56.1,56.0,46.5;ESI-MS，m/z：187.1[M+H]+。

(3,4-二甲氧基芐基)三苯基氯化膦(Ⅳ)：1HNMR(300 MHz,DMSO-d6)，δ：7.51～7.49(3H,m,ArH),7.45(6H,dt,J=3.6 Hz、8.1 Hz,ArH),7.15～7.11(6H,m,ArH),6.86(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.82(1H,dd,J=1.8 Hz、8.1 Hz,H-6),6.73(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.86(2H,J=15.0 Hz,Ar-CH2-),3.83(3H,s,-OCH3),3.75(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,DMSO-d6)，δ：149.7,146.8,137.4,136.2,128.8,128.6,122.3,121.4,114.1,112.3,57.8,56.2,56.1;ESI-MS，m/z：483.1[M+Cl]-。

3,4-二甲氧基-4′-氯聯芐(Bd)：1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：7.25(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),7.09(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),6.80(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.70(1H,dd,J=1.8 Hz、8.4 Hz,H-5),6.70(1H,d,J=1.8 Hz,H-3),3.88(3H,s,-OCH3),3.85(3H,s,-OCH3),2.86(4H,brs,-CH2CH2-);13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：159.3,156.3,131.4,128.7,127.5,127.3,121.1,115.0,111.8,105.1,56.2,56.1,38.1,37.6;ESI-MS,m/z:314.7[M+K]+。

2.2 抑制HepG2細胞己糖激酶2活性

Bd誘導HK2從線粒體脫落至細胞質的激光共聚焦顯微鏡照片見圖2。

a.對照組 b.0.1 μmol·L-1 Bd c.1 μmol·L-1 Bd

從圖2可以看出，在HepG2細胞內，HK2染色為綠色熒光，線粒體染色為紅色熒光，核染色為藍色熒光。對照組Merge照片顯示，HK2結合在線粒體上綠色與紅色熒光融合為橙色熒光。當用不同濃度的Bd處理HepG2細胞后，隨著Bd濃度的升高，橙色熒光逐漸減弱，說明HK2從線粒體上脫落至細胞質中，HK2喪失活性，有氧糖酵解被抑制，推測Bd可能是通過抑制有氧糖酵解而發揮抗肝癌作用，進一步機制正在研究中。

3 結論

以3,4-二甲氧基苯甲醛為原料，以Wittig反應作為關鍵步驟，通過5步反應合成了3,4-二甲氧基-4′-氯

聯芐(Bd)，通過1HNMR、13CNMR和ESI-MS確證了其結構；采用激光共聚焦免疫熒光實驗評價了Bd對有氧糖酵解關鍵限速酶HK2活性的影響。結果顯示，在HepG2細胞中，Bd可以促使HK2從線粒體脫落至細胞質中，表明Bd可能通過抑制HK2活性發揮抗肝癌作用。