高效液相色譜-串聯質譜法測定菌渣有機肥中紅霉素殘留量

謝 芳，易鴛鴦，吳智慧，胡瀟涵，張 琳

(新疆環境保護科學研究院，新疆環境污染監控與風險預警重點實驗室，新疆清潔生產工程技術研究中心，新疆 烏魯木齊 830011)

我國每年生產的抗生素有70多種，年產量占全世界的70%。按1 t抗生素產生10 t菌渣計算，每年會產生200 t菌渣。國家環保部將抗生素菌渣列入《國家危險廢物名錄》。殘留的抗生素不僅會對生態系統造成破壞，而且對人體健康造成潛在危害[1-2]，抗生素殘留問題亟待解決。

紅霉素類抗生素通過垃圾填埋場的菌渣滲濾液或者其它方式滲透到環境土壤中。所以，對于抗生素菌渣作為肥料施用后在土壤中的殘留量進行檢測是有必要的。目前，測定抗生素殘留量的方法主要有微生物法、免疫法、光譜法、色譜法、液質聯用法等[3-5]。其中，微生物法測定時間長、誤差較大；免疫法由于會發生交叉反應等不足，不適用于殘留抗生素的測定；高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)具有選擇性高、特異性好、靈敏度高[6-7]、分離效率高、能夠直接得到待測物質的結構與相對分子量等特點，可以達到快速、可靠分析樣品的目的。鑒于此，作者建立HPLC-MS/MS測定菌渣有機肥中紅霉素殘留量的新方法，為檢測抗生素菌渣作為肥料施用后在土壤中的殘留量提供思路。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

土壤樣品采集于新疆某制藥企業試驗基地。播種前，農田A1地塊、A2地塊分別按每畝500 kg、1 000 kg施入紅霉素菌渣有機肥，以空間代替時間序列法采集播種期、出苗期、開花期和成熟期等四個時期的土樣，分別選取對角線5點法采集表土層(0～20 cm)土樣，剔除石頭、植物根系、枯枝落葉等雜質后混勻，用四分法保留500 g送至實驗室，于通風處風干，過20目篩，儲存于密封袋中，于4 ℃保存備用。

CaCl2，天津盛奧化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，上海青析化工科技有限公司；氨水，西隴化工股份有限公司；1，2-二氯乙烷，色譜純，天津北聯精細化學品開發有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，Fisher公司；紅霉素標準品(98%)，色譜純，河北百靈威超精細材料有限公司；其它試劑均為分析純；實驗用水為蒸餾水或去離子水。

TSQ-Quantum Access MAX 型高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀，美國賽默飛世爾公司；ASE-350型加速溶劑萃取儀，美國DIONEX公司；RV10型旋轉蒸發儀，德國IKA；AutoEVA-20Plus型全自動氮吹濃縮儀，睿科集團股份有限公司；TDL-5A型大容量離心機，湖南星科科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量紅霉素標準品，用甲醇溶解，配制成50 mg·L-1的紅霉素標準儲備液，避光4 ℃冷藏保存；用甲醇逐級稀釋，得到濃度(μg·L-1)分別為1、10、50、100、500、1 000的系列紅霉素標準溶液，現配現用。

1.3 樣品預處理

參考專利[8]，并結合實際樣品對預處理方法進行優化。準確稱取土樣1.0 g(精確至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入乙腈-Tris-CaCl2溶液15 mL，充分振蕩1 min后超聲提取30 min，3 800 r·min-1離心5 min，取上清液。重復操作2次，合并上清液。

將上清液在旋轉蒸發儀上濃縮至5 mL左右，轉移至50 mL聚丙烯離心管，加入pH值為6的Tris-CaCl2溶液10 mL，充分渦旋振蕩1 min；加入400 μL氨水調節pH值為10，加入1 mL甲醇溶液；快速注射1 mL萃取劑1,2-二氯乙烷，充分振蕩30 s，3 800 r·min-1離心5 min，取底層液體；重復萃取步驟，合并含有目標物的1,2-二氯乙烷，氮吹濃縮后用甲醇定容至1 mL，經0.45 μm濾膜過濾至液相用樣品瓶中，待測。

1.4 色譜及質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Waters Symmetry-C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，USA)；流動相為0.1%甲酸(A)-甲醇(B)，采用梯度洗脫(表1)；柱溫30 ℃；流速0.3 mL·min-1；進樣量2 μL。

表1 高效液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件

電子噴霧(ESI)離子源；反應監測(SRM)正離子掃描模式；鞘氣和輔助氣為氮氣；碰撞氣為氬氣；噴射電壓3.5 kV；離子傳輸毛細管溫度300 ℃；掃描寬度0.01；掃描時間0.02 s。質譜掃描參數見表2。

表2 質譜掃描參數

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

首先以甲醇和乙腈溶液作為流動相，結果顯示，甲醇為流動相時基線穩定且響應值較高，離子化效率和分析靈敏度較乙腈的高。采用0.1%甲酸溶液能改善分析物的色譜峰形，提高分析物的響應值，保證高的靈敏度，且峰形尖銳對稱，無拖尾和雙頭峰等現象。紅霉素是極性較強化合物，為了色譜峰的分離效果更好，最終確定采用0.1%甲酸-甲醇作為流動相，并梯度洗脫。

2.2 質譜條件優化

根據紅霉素結構特征，采用ESI正離子掃描模式。將2 000 μg·L-1紅霉素標準溶液以5 μL·min-1進入離子源，正離子全掃描，找出M+1峰，分別用于轟擊母離子，即可找出3個較強信號的子離子，母離子和子離子共同組成監測離子對，進行定性和定量分析。采用自動優化和手動優化相結合的方式對質譜條件進行優化，確定最佳質譜條件為： ESI離子源；SRM正離子掃描模式；鞘氣和輔助氣為氮氣；碰撞氣為氬氣；噴射電壓3.5 kV；離子傳輸毛細管溫度300 ℃；掃描寬度0.01；掃描時間0.02 s。不同濃度紅霉素的總離子流圖見圖1。

圖1 不同濃度紅霉素的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Erythromycin with different concentrations

2.3 線性范圍和檢出限

取系列紅霉素標準溶液按1.4.1條件進樣測定，以積分面積(y)對紅霉素質量濃度(x)進行線性回歸，擬合得紅霉素的標準曲線(圖2)。

圖2 紅霉素的標準曲線Fig.2 Standard curve of Erythromycin

由圖2可知，紅霉素的標準曲線回歸方程為y=7134.43x-64383.6，相關系數R2=0.9992。以信噪比S/N=3計算檢出限(LOD)，為0.2 ng·L-1。

2.4 精密度和加標回收率

取紅霉素標準溶液按1.4.1條件進樣測定，每個濃度做5個平行，進樣量為2 μL，相對標準偏差(RSD)為2.98%～3.57%，表明該方法的精密度良好；實際樣品的加標回收率為70.3%～90.7%，RSD低于5.0%(表3)。

表3 精密度和加標回收率結果(n=5)

2.5 紅霉素殘留量檢測(表4)

由表4可知，紅霉素在大豆和玉米的播種期、開花期、成熟期均未檢出。A1地塊出苗期均未檢出；A2地塊大豆和玉米出苗期的紅霉素殘留量分別為0.3 ng·g-1、0.2 ng·g-1，殘留量非常低。

表4 紅霉素殘留量/(ng·g-1)

3 結論

對色譜條件和質譜條件進行了優化，建立了測定菌渣有機肥中紅霉素殘留量的HPLC-MS/MS法。采用該方法檢測大豆和玉米不同生育期(播種期、出苗期、開花期、成熟期)土壤中紅霉素殘留量，其中A1地塊四個時期均未檢出，A2地塊大豆和玉米出苗期均有檢出，紅霉素殘留量分別為0.3 ng·g-1和0.2 ng·g-1。該方法準確、靈敏，可用于菌渣有機肥中紅霉素殘留量的測定。