桑葉黃酮類化合物的研究進展

羅文濤，馮菊紅*，王理想，何少男，孫錕輝，劉 祺，胡學雷

(1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

桑葉又名冬桑葉、霜桑葉、鐵扇子、枯桑葉等，是桑科植物桑(MorusalbaL.)的葉子。我國是世界上最早種植桑樹的國家，桑樹在我國大部分地區多有種植，尤其是長江中下游地區和四川盆地。桑葉產量豐富，除了作為蠶的主要食物外，也是一種重要的中藥材和保健食品。桑葉作為中藥使用已有4 000多年的歷史，在世界上第一部藥典《唐本草》中記載了桑葉的藥用功效。桑葉味甘、苦，性寒，能疏散風熱，熱肺潤燥，清肝明目，平抑肝陽。桑葉中含有多種藥理活性成分，主要是黃酮類、生物堿類、甾體和多糖類化合物。其中，黃酮類化合物的含量占桑葉干重的2%左右，是桑葉中化學成分研究最多、化學結構明確的一類天然產物。黃酮類化合物的基本骨架為2-苯基色原酮(圖1)。

圖1 黃酮類化合物的基本骨架Fig.1 Basic skeleton of flavonoids

桑葉黃酮類化合物(mulberry leaf flavonoids,MLFs)多含酚羥基，顯酸性，且其酸性強弱與酚羥基的數目和位置有關。MLFs苷元多為結晶性固體，糖苷化后多為無定形粉末，且糖苷化后水溶性會增強。MLFs主要包括蕓香苷、桑色素和槲皮素等，具有抗氧化、抗癌和改善心血管功能等多種藥理學作用，有較好的研究價值和應用前景。作者就近15年來MLFs的提取方法、分離純化方法、含量檢測和藥理學作用等方面研究進行簡要綜述。

1 MLFs的提取方法

MLFs的提取方法主要包括有機溶劑法、超聲波輔助法、微波輔助法、超臨界CO2法等。研究[1]表明，影響MLFs提取的因素主要有提取溶劑、提取溫度、提取時間和料液比等。使用不同種類、不同濃度的溶劑提取的MLFs含量有所不同。提取溫度對分子熱運動有顯著影響，當提取溫度較低時，溶劑分子運動較緩慢，提取的MLFs含量較低；當提取溫度過高時，有可能會破壞MLFs的化學結構。一般情況下，提取時間越長，MLFs溶出越充分，但同時也增加了雜質的溶出。溶劑用量越多，提取的MLFs含量越高，但雜質含量也越高。

1.1 有機溶劑法

傳統的水提取法因部分MLFs組分不溶于水，導致MLFs浸出率較低。有機溶劑法使用甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑提取，可以提高MLFs含量。該法操作簡便，易于放大。Kobus-Cisowska等[2]比較了小分子醇、丙酮和水等溶劑對提取MLFs的影響，結果表明，以丙酮為提取溶劑時，MLFs含量最高；以乙醇為提取溶劑時，MLFs的抗氧化活性最高；以水為提取溶劑時，MLFs的抗氧化活性最低。Cui等[3]優化了MLFs的提取條件，在乙醇體積分數為39.3%、料液比為1∶34.6 (g∶mL，下同)、提取溫度為70.85 ℃、提取時間為120.18 min的最優條件下，MLFs含量最高，為50.52 mg·g-1。

1.2 超聲波輔助法和微波輔助法

超聲波輔助法的原理是當超聲波作用于介質時，會產生正負不同的壓強相位，撕裂介質，形成空洞，并使溫度升高和攪拌加劇，具有提取效率高、耗時較短、可提取熱不穩定成分等特點。張齊[4]在提取溶劑為75%乙醇、料液比為1∶25、提取溫度為70 ℃的條件下超聲提取MLFs 1.5 h，MLFs含量為2.96%。

微波輔助法的原理是介質中的極性分子隨電磁場頻率的變化而改變排列取向，導致分子運動和摩擦，產生熱效應，具有提取效率高、耗時較短、溶劑用量少等特點。陳菁菁等[5]對比了有機溶劑法和微波輔助法對MLFs的提取效果，在提取溶劑為70%乙醇、料液比為1∶12的條件下，當微波輔助功率為450 W、提取溫度為60 ℃、提取時間為20 min時，MLFs含量為2.87%；而采用有機溶劑在90 ℃下回流提取2 h，MLFs含量為1.85%，微波輔助法提取MLFs含量更高，較有機溶劑法提高了55%。

超聲-微波協同法結合了超聲波輔助法和微波輔助法，既有超聲波輔助法的空化效應，又有微波輔助法的熱效應，具有提取效率高、耗時短等特點。李莉等[6]采用超聲-微波協同法提取MLFs，在提取溶劑為65%乙醇、提取功率為400 W、提取時間為12 min、料液比為1∶10的條件下，MLFs含量為3.07%。

1.3 超臨界CO2法

超臨界CO2法以超臨界CO2流體為萃取劑，通過改變CO2流體溫度或壓強，使超臨界CO2流體密度發生變化，進而改變其溶解能力。該法中CO2無毒害作用，且對提取物的破壞較小。王昕宇等[7]采用超臨界CO2法萃取MLFs，在壓力為35 MPa、溫度為45 ℃、夾帶劑為200 mL、CO2流量為10 kg·h-1的條件下處理300 g桑葉，MLFs含量為7.68%。表明，超臨界CO2法的提取效率優于有機溶劑法，且無溶劑殘留，可用于MLFs的大規模提取。

1.4 其它提取方法

熊知行等[8]采用酶法提取MLFs，發現加入纖維素酶能破壞細胞結構，提高MLFs的提取效率。

堿提酸沉法：MLFs為酸性，可用弱堿溶液為提取溶劑進行提取，再在酸性條件下沉淀析出。該法提取的雜質較多，污染較大，若提取溶劑堿性太強，會破壞黃酮母核；若沉淀時酸性太強，會生成烊鹽，使MLFs重新溶解。

2 MLFs的分離純化方法

通過不同方法提取的MLFs是黃酮類化合物的混合物，經初步分離純化得到MLFs粗品。如果要得到結構單一的黃酮類化合物，需要對MLFs進行進一步分離純化。

2.1 初步分離純化

從提取液中分離MLFs粗品主要采用大孔吸附樹脂柱層析法。目前，關于大孔吸附樹脂方面的研究主要集中于大孔吸附樹脂的種類、分離純化溫度、洗脫劑種類及濃度、料液比等的選擇和優化。影響樹脂吸附性能的因素包括樹脂的極性、骨架結構、比表面積和平均孔徑大小，以及被吸附物質的極性和分子大小等。一般而言，樹脂與分子極性越相似，越易吸附，但越難解析；樹脂的相對比表面積越大，吸附能力越強；樹脂的相對孔徑越大，擴散速度越快，但選擇性越低。王俊等[9]采用樹脂吸附法分離純化MLFs，選擇H103型樹脂固定床，在上樣流速為9 mL·min-1、MLFs初始濃度為6.05 mg·mL-1、洗脫劑為60%乙醇、洗脫流速為4.5 mL·min-1的條件下，MLFs收率為90.57%，純度為76.33%。

除了大孔吸附樹脂外，分離MLFs粗品還可用硅膠、聚酰胺、纖維素粉作為吸附劑或載體，此外，氧化鋁、氧化鎂及硅藻土等也有應用。

2.2 進一步分離純化

黃酮類化合物的骨架結構、骨架上的酚羥基和糖基等是決定其物化性質的重要因素，使其顯示出不同的極性、酸性、分子量和化學反應性。根據這一特性，可采用下列方法對MLFs進行進一步分離純化，以得到單一組分。

(1)溶劑萃取法：使用不同極性的溶劑，經過反復萃取，分離出不同組分。該法很難直接分離出單一組分，常結合色譜法或重結晶法進一步分離。

(2)色譜法：Ju等[10]采用液質聯用法對12種韓國MLFs組分進行了定性和定量分析。其中，含量最高組分的是蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-(6′-O-丙二酰)葡萄糖苷。

(3)梯度pH值萃取法：根據MLFs不同組分的酸性差異，可以采用不同酸性的洗脫劑將其分離。常用洗脫劑有NaHCO3、Na2CO3、稀NaOH和濃NaOH溶液[11]。

(4)高效毛細管電泳(HPCE)法：利用電泳和電滲流現象，不同MLFs組分在不同電場力的作用下被分離。該法分離效率高，進樣量極少，其柱效遠高于高效液相色譜(HPLC)法。張軍等[12]采用HPCE法對不同種類、不同時期的MLFs進行分離和測定，緩沖液為pH 值8.62的磷酸二氫鈉和硼砂溶液，溫度為25 ℃，壓力為20 kV，檢測波長為245 nm，8 min內組分分離完全，測得湖桑品種中蘆丁和槲皮素含量最高，并且10月份采摘桑葉中蘆丁和槲皮素含量最高。

(5)微乳薄層層析法：以微乳為展開劑，用薄膜進行分離。該法分離效果好，靈敏度高。李升鋒等[13]采用微乳薄層層析法分離MLFs，將微乳層析液調酸后，經聚酰胺薄膜分離。結果顯示，分離出12個斑點，分離效果較好，其中蘆丁含量較高。

3 MLFs的含量檢測

MLFs含量檢測不僅與提取、純化方法有關，也與桑葉本身所含MLFs含量有關。桑葉的種類、部位以及光照強度、土壤環境和季節變化等都是影響MLFs含量的重要因素[14]。在一定范圍內，MLFs含量隨光照強度的增大而升高。Krajnc等[15]研究發現，對桑樹進行修剪，蛋白質和MLFs含量會升高。Przeor等[16]研究發現，白桑葉在60 ℃下干燥時，MLFs含量最高。

3.1 紫外可見分光光度法

紫外可見分光光度法的原理是部分MLFs能與鋁離子發生絡合反應顯色，其顏色的深淺與MLFs含量呈比例，故可以通過測定吸光度計算MLFs含量。該法具有操作簡單、重現性好等特點。穆建峰[17]確定的MLFs最佳提取條件為：料液比1∶20、提取溫度70 ℃、提取溶劑50%丙酮、超聲時間40 min，并采用硝酸鋁顯色法測定MLFs含量，檢測波長為510 nm，得回歸方程為y=11.066x-0.0001(R2=0.9995)，測得MLFs含量為2.78%。張國權等[18]采用三氯化鋁比色法測定MLFs含量，檢測波長為400 nm，得回歸方程為y=0.0298x-0.0018(R2=0.9995)，MLFs含量在0.001～0.016 g·L-1范圍內線性關系良好。

3.2 熒光光度法

紫外線照射物質后使其處于激發態，在去激發過程中會發射反映物質特性的熒光，若該物質不發射熒光，可使用熒光染料與其生成絡合物。熒光光度法利用這一性質，在有鋁離子存在的條件下測定MLFs含量。該法具有靈敏度高、重現性好等特點。王艷[19]采用熒光光度法測定MLFs含量，標準品為蘆丁，激發波長為436 nm，發射波長為483 nm，得回歸方程為y=17.913x+1.388(R2=0.9999)，檢測限為1.36×10-9mol·L-1。

3.3 高效液相色譜法

HPLC法可分離多種組分，并進行定量分析，準確度高，重復性好。Kim等[20]研究發現，經超聲處理0.5 h的酸性甲醇是HPLC法檢測MLFs的最佳流動相。Zhang等[21]利用手性HPLC分離和檢測了MLFs中的立體異構體。Kim等[22]采用酶法提取桑葉有效成分，通過HPLC法分離并檢測了5種組分。

4 MLFs的藥理學作用

黃酮類化合物具有多種藥理學作用，包括改善心血管功能、保護肝臟、抗炎、抗菌、抗病毒、雌激素樣作用、瀉下作用和解痙作用等[23-24]。

4.1 抗氧化

MLFs具有減少或清除自由基，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性和提高細胞抗氧化能力，減少細胞和組織損傷，進而減少心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發生，延緩衰老和延長壽命。Hosseinzadeh等[25]研究發現，MLFs組分中的蘆丁可抑制自由基對肝、胃腸道等的損害。Chon等[26]研究了桑葉提取物中總酚含量與清除自由基能力的關系，結果表明，總酚含量越高，清除自由基能力越強。此外，還有研究[27]表明，桑葉提取物經β-葡萄糖苷酶處理，槲皮素含量明顯提高，桑葉提取物的胞內抗氧化能力增強。

4.2 降血脂

MLFs可以抑制腸道內膽固醇的吸收，降低血脂濃度，減少高血脂癥的發生。此外，MLFs可通過清除體內自由基、螯合金屬離子、影響SOD活性來提高血管內高密度脂蛋白(HDL)與低密度脂蛋白(LDL)的比率，預防動脈粥樣硬化。研究[28]表明，MLFs能改善小鼠的腸道環境，調節脂質代謝。Hu等[29]通過大鼠試驗，發現MLFs可以通過減少膽固醇的累積治療肝類疾病。

4.3 降血糖

MLFs可以抑制胰島β-細胞凋亡，減少血糖攝入，降低血糖濃度。此外，MLFs可通過清除體內多余自由基、提高SOD活性和提高細胞抗氧化能力來減少對肝臟和胰島細胞的破壞，提高機體降血糖能力。研究[30]表明，MLFs可以調節腸道內菌群，改善由糖尿病引起的并發癥。據相關文獻[31-32]報道，MLFs可以調節糖代謝，校正高血糖癥。Kim等[33]經體外降糖性能實驗，發現MLFs具有降糖活性。

4.4 美白

MLFs可以通過抑制體內的酪氨酸酶活性，抑制酪氨酸轉化為黑色素，起到美白作用。此外，MLFs可通過清除自由基和提高細胞抗氧化能力，減緩由自由基攻擊細胞導致的衰老，延長壽命。邢凱等[34]以MLFs為原料，制備了具有控脂美白效果的面膜，測試了其pH值、熱穩定性、黏度、結構穩定性和刺激性。結果表明，面膜的pH值適宜、熱穩定性較強、黏度適宜、結構穩定性良好、刺激性適宜，且感官性能評價優良，具有抑制皮膚油脂分泌、美白的功效。

4.5 抗高血壓

MLFs中的蘆丁和槲皮素等成分具有維生素P樣作用，可增強血管柔韌性，改善血管通透性，具有很好的擴冠作用，可起到抗高血壓作用。陳迎霞[35]開發了一種含MLFs的中藥湯劑，可用于治療由高血壓引起的頭暈，還可清熱去火，安全性較好。

4.6 其它作用

Thabti等[36]研究表明，MLFs能抵抗新冠病毒。Cai等[37]經大鼠試驗，證實飼料中添加桑葉能使動物增重。Tomczyk等[38]發現桑葉能提高淀粉酶活性，豐富蜂蜜營養。研究[39-42]表明，MLFs能增強仔豬對疾病的抵抗力；改善牛的瘤胃環境，抵抗氧化，促進水牛生長；提高雞蛋蛋黃的黃度；提高家禽消化和繁殖能力，促進家禽生長，提升肉質口感和營養。MLFs可能通過抑制脂氧合酶，改變前列腺素(PEG)的生物合成過程，進而起到抗炎效果。此外，桑葉中的槲皮素、桑色素等具有抗病毒作用。

5 展望

MLFs含量較高，活性較好，且具有多種藥理學作用，因而對MLFs的研究已成為學者們關注的熱點之一。目前，關于MLFs的研究主要集中在MLFs的提取和分離純化方面，對于MLFs藥理學作用的研究也逐漸增多。今后，可以從以下幾個方面對MLFs開展進一步研究：(1)將目前進行的MLFs研究放大應用于實際大規模生產中；(2)采用HPLC法等分離純化手段分離出MLFs單一組分，并研究單一組分的藥理學作用；(3)MLFs的抗氧化作用較強，可進一步研究其體內抗氧化作用；(4)進一步研究MLFs的藥理學作用機制，以提高桑葉的利用價值；(5)拓寬MLFs的應用范圍，研發相應的食品、飲料、飼料添加劑、化妝品等；(6)研究影響MLFs含量的外在因素，設計更好的培育方法。

總之，桑葉作為一種天然產物，在具有高效的藥理學作用的同時，又具有安全、易大量培育和應用廣泛等特點，使得MLFs具有廣闊的研究前景，對其研究會越來越深入和全面。