一株撒壩豬源大腸桿菌噬菌體的生物學特性研究

萬 全，張 博，高飛龍，單春蘭，趙維薇，鄧 靜，王 喜，趙 汝，高利波，高 洪*

(1. 云南農業大學 動物醫學院，云南 昆明 650201；2. 云南農業大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201； 3.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)通常稱大腸桿菌，革蘭氏陰性菌，顯微鏡下呈桿狀，無芽孢，是人和溫血動物腸道內正常菌群成員之一[1-2]。后來陸續有研究發現某些特殊血清學的大腸桿菌可引起人畜類疾病，尤其對嬰幼兒和幼畜，極易引起嚴重腹瀉及敗血癥甚至死亡[3]。D'rlerelle等[4]發現噬菌體并成功地將噬菌體應用于細菌性疾病的治療，拉開了噬菌體研究的帷幕。噬菌體是一類能夠專一性感染其宿主菌的病毒，宿主菌可以是細菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物[5]，具有病毒的一般特性，個體微小、無完整的細胞結構且只有一種核酸作為遺傳物質，利用宿主菌的復制合成自身成分并組裝，通過破壞宿主菌來釋放子代噬菌體，通常情況下，有細菌的地方就有相應的噬菌體存在，與宿主菌共斗爭共進化，在應對細菌感染疾病方面具有重要的潛力[6-7]。迄今為止對噬菌體的研究主要集中于革蘭陽性菌源，常見革蘭陰性菌源噬菌體的研究則鮮見報道，故而本研究從大腸桿菌源噬菌體出發，旨在探究噬菌體的分離鑒定方法并了解其生物學特性，以期為噬菌體的進一步應用及相關研究提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云南撒壩豬源大腸桿菌分離株，由云南農業大學動物醫學院病理實驗室鑒定并保存(96株撒壩豬源大腸桿菌中92株已確定血清型，分屬9個血清型，其中優勢血清型為O12、O16和O119，分別占分離菌株的20.83 %、14.58 %和15.63 %)。LB肉湯培養基、LB瓊脂培養基、SM緩沖液，細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA片段純化試劑盒均購自于天根生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 噬菌體的分離與純化

噬菌體的分離采用増殖分離法[8]，并對其進行純化培養后保存以備開展后續實驗研究。

1.3 噬菌體的衣殼蛋白gp23基因鑒定

根據GeneBank基因庫中噬菌體衣殼蛋白gp23基因序列保守區域設計引物，序列為F：5'-TGTTATGGTATGGTCGCGTGCTAT-3'；R：5'-TGAAGTTACCTTCACCACGACCGG-3'，經PCR擴增得到衣殼蛋白gp23基因，目的片段大小預期為850 bp左右。擴增產物經純化回收送至公司測序，經序列比對后進行遺傳進化分析。

1.4 噬菌體效價及裂解譜的測定

雙層平板法測定噬菌體效價，純化后的噬菌體懸液用SM緩沖液作10倍連續稀釋，每個稀釋度取100 μL，加入到0.1 mL宿主菌懸液中混合均勻，并于37 ℃溫箱培養過夜，測定噬菌斑數量根據公式計算噬菌體效價，每個稀釋度重復試驗3次，取平均值。噬菌體的裂解譜測定采用單斑法[9]，取200 μL培養至對數期的待測菌懸液均勻涂布于普通瓊脂平板上，分別取5 μL噬菌體懸液滴于平板上，干燥后置于37 ℃溫箱培養8 ～10 h后觀察結果。試驗重復3次并設置對照組。

1.5 噬菌體生化特性的鑒定

1.5.1 最佳感染復數的測定 將噬菌體懸液接種至10 mL LB培養基中，于37 ℃恒溫振蕩培養至對數前期，噬菌體懸液和宿主菌分別按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的比例混合均勻，加入LB液體培養基使各管總體積相同。37 ℃、160 rpm振蕩培養4 h，2 000 g離心10 min，收集上清，經稀釋后測定效價。

1.5.2 噬菌體熱穩定性的測定 取100 μL純化增殖后的噬菌體懸液于無菌EP管中，分別于40 ℃、50 ℃、60 ℃水浴中作用30 min和60 min。水浴結束后立即將EP管置于冰浴中冷卻，經稀釋后測效價。試驗重復3次。

1.5.3 噬菌體pH穩定性的測定 取無菌EP管分別加入不同pH(4、5、6、7、8、9、10、11)的LB培養基，置于37 ℃恒溫水浴，待溫度平衡后加入100 μL純化增殖后的噬菌體懸液，37 ℃恒溫作用10 h。作用時間結束后測定各管噬菌體效價。試驗重復3次。

1.5.4 生長曲線的繪制 參照Lu等[10]和Zhang等[11]的方法測定生長曲線。以感染復數為10-5的比例將噬菌體及宿主菌充分混勻，37 ℃溫育15 min后，12 000 g離心30 s，棄上清液，用SM緩沖液洗滌沉淀以去除游離的未吸附于宿主菌的噬菌體，加入10 mL LB培養基并充分混勻，于37 ℃、160 rpm振蕩培養并開始計時，從感染開始起每隔10 min取樣100 μL，12 000 g離心30 s，取上清測定噬菌體滴度，試驗重復3次并取平均值，同時設置對照組。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離與純化

試驗分離過程中對噬菌體原液反復純化5～6次，直至得到的噬菌斑形態、大小均一致，即為1株純化噬菌體，本試驗得到的噬菌斑為直徑0.5～1 mm，邊緣整齊，呈乳白色的圓形噬菌斑。

2.2 衣殼蛋白gp23基因的擴增及遺傳進化分析

經PCR擴增噬菌體衣殼蛋白gp23基因，于瓊脂糖凝膠電泳后呈現出850 bp左右的擴增條帶，與預期大小相一致(見圖1)。

圖1 噬菌體衣殼蛋白gp23基因 PCR擴增產物M. DL2000 DNA marker；1. 衣殼蛋白gp23基因；2. 陰性對照Fig.1 The amplification product of phage capsid proteingp23 gene by PCRM. DL2000 DNA marker；1. Capsid protein gp23 gene;2. Negative control

用DNAstar軟件對序列進行比對及遺傳進化分析。結果顯示，分離得到的噬菌體與有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科，T4-like噬菌體屬的slur14處于同一小分支，親緣關系最近(見圖2)。

圖2 基于衣殼蛋白gp23核苷酸序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on thenucleotide sequence of capsid protein gp23

2.3 噬菌體效價和裂解譜的測定結果

由表1知，分離株對57株大腸桿菌具有裂解性，裂解率為61.95%，對25株大腸桿菌具有完全裂解性，完全裂解率為27.17%，針對優勢血清型O12、O16和O119的裂解率分別為70%、71.4%和60%，表明該噬菌體具有較寬泛的噬菌譜和較強的裂解性。

表1 噬菌體的裂解譜結果Table 1 Experimental results of phage fragmentation spectrum

2.4 噬菌體生化特性分析

2.4.1 最佳感染復數測定結果 由表2可見，當噬菌體和宿主菌以10-6比例混合后，產生的子代噬菌體數量最多，噬菌體的效價高達6.95×109pfu/mL，表明噬菌體最佳感染復數為10-6。

表2 不同感染復數下噬菌體的效價Table 2 Bacteriophage titers at differentmultiplicities of infection mL

2.4.2 熱穩定性測定結果 由表3可見，在40 ℃環境下作用30 min后，噬菌體基本保持原活性，作用60 min后，效價下降不明顯；在50 ℃下分別作用30 min和60 min后，其效價仍維持在108pfu/mL以上；60 ℃作用30 min和60 min后，噬菌體效價下降變化較大，分別降低了3個和4個數量級。

表3 不同溫度下噬菌體的效價Table 3 Phage titers at different temperature

2.4.3 pH穩定性測定結果 由表4可見，在pH 5～9范圍內，噬菌體效價均可保持在108pfu/mL以上，特別是在pH為7和8的時候，噬菌體的活性最高；隨著pH的逐漸降低或升高，在pH<5或pH>9時，噬菌體的效價顯著下降。

表4 不同pH環境作用下噬菌體的效價Table 4 Phage titers in different pH environments

2.4.4 生長曲線繪制結果 由圖3可見，噬菌體感染宿主菌的潛伏時間約為30 min，爆發時間約為120 min。根據裂解量計算公式，計算得出該噬菌體裂解量為41 pfu/cell。

圖3 噬菌體一步生長曲線Fig. 3 One-step growth curve of phage

3 討 論

大腸桿菌作為食源性疾病及腸道感染疾病的重要病原，伴隨抗生素的大量和不合理使用，多重和交叉耐藥性問題日趨嚴重，已經威脅到公共衛生安全[12]。在新型抗菌制劑的研發極為迫切之時，噬菌體作為一種潛在的抗菌制劑重新得到大家的重視[13]。此外，作為細菌的天敵，噬菌體被認為是一種潛在的抗生素替代物，或者說，是當前多重耐藥性背景下對抗生素的一種重要補充[14]。對噬菌體進行分離和鑒定是進一步開展研究的基礎和前提，對噬菌體生化特性的探究可為了解噬菌體的適用范圍，保障其更好的發揮效能而奠定基礎。

本研究采用雙層瓊脂平板法，自某規模化養殖場采集的糞便所分離的大腸桿菌増殖分離純化出1株裂解性噬菌體，并通過相關基因鑒定及生物信息學軟件分析，判定出分離株屬有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科T4-like噬菌體。本研究結果顯示，該噬菌體效價較高，表明其可能具有良好的抑菌應用價值。裂解試驗結果顯示該噬菌體具有較寬的裂解譜，為1株寬泛噬菌體。姜姍等[15]所分離得到的噬菌體也表現出寬宿主譜特性，可同時裂解不同動物來源的腸道內和腸道外大腸桿菌。鑒于大腸桿菌種類繁多，寬宿主譜的噬菌體的獲得具有非常重要的意義[16]。該噬菌體在大腸桿菌宿主菌上的最佳感染復數為10-6，其確定將有利于獲得高效價的噬菌體懸液，為噬菌體的大量制備提供數據支撐。該噬菌體在較廣的溫度范圍內均能保持較高活性，60 ℃作用30 min后，效價才表現明顯下降。Lu等[17]分離的乳酸桿菌源噬菌體甚至可耐受100 ℃高溫，推測不同噬菌體之間的溫度穩定性可能存在明顯差異。研究表明，噬菌體溫度穩定性的差異可能是由噬菌體表面特異性吸附蛋白的不同造成的[18]。pH通過影響噬菌體和宿主細胞表面所帶電荷的改變，進而影響噬菌體對宿主細胞的吸附作用，適宜的pH更有利于噬菌體的吸附[19]。本研究中，該噬菌體對pH的穩定性較好，可以在pH為5～9范圍內保持較高效價。一步生長曲線可以清楚的顯示噬菌體的生長規律，體現噬菌體的潛伏期、裂解期和裂解量等參數。本試驗測得噬菌體的潛伏期為30 min，裂解量達41 pfu/cell相關研究表明潛伏期短和裂解量大的噬菌體是比較理想的選擇[20]。

4 結 論

本研究結果表明，從撒壩豬源大腸桿菌分離到的一株裂解能力較強、裂解譜較廣且對理化因素耐受力較強的T4-like噬菌體。