實時熒光定量多聚酶鏈反應擴增技術聯合濃縮涂片染色法快速診斷結核病的效果

李 喬，吳 健，陳澤城

（高州市人民醫院檢驗科，廣東 高州 525200）

防治結核病是全球面臨的公共衛生問題。大量的研究表明，盡早地對結核病患者的病情進行診治是控制其病情發展的關鍵[1-3]。目前，臨床上常采用直接涂片染色法、改良羅氏培養法、MGIT-960 培養法等對結核病患者的病情進行診斷。本文主要是探討用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法快速診斷結核病的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文的研究對象是2016 年6 月至2020 年6 月期間高州市人民醫院檢驗科收到的526 份分泌物標本。在這526份分泌物標本中，痰液標本有427 份，支氣管沖洗液標本有37 份，尿液標本有25 份，胸腹液標本有25 份，膿液標本有5 份，腦脊液標本有2 份，心包液標本有2 份，組織標本有2 份，精液標本有1 份。

1.2 方法

采用直接涂片染色法進行病原體檢測的方法是：按照《痰涂片鏡檢質量保證手冊》的要求，將分泌物標本均勻地涂抹在載玻片上，并進行抗酸染色操作[4]。染色完畢后，將載玻片放置于顯微鏡下進行檢查。采用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法進行病原體檢測的方法是：將5 ～10 mL 的分泌物標本放置在50 mL 離心管中。按照《結核病細菌學檢驗規程》及BACTEC MAGIT-960 操作規程進行堿消化濃縮操作[5]。在沉渣中加入0.7 ～1 mL 的PBS緩沖液（pH=6.8），制成混合液。對該混合液進行離心處理，制成離心沉渣懸浮液。將0.1 mL 的離心沉渣懸浮液加入到DNA 提取管中，將0.5 mL 的離心沉渣懸浮液加入到BACTEC MGIT-960 培養管中，取0.1 mL 離心沉渣懸浮液制成規格為10 mm×10 mm 的載玻片，然后，按照結核分歧桿菌核酸擴增熒光檢測試劑說明書的要求，將DNA 提取管、BACTEC MGIT-960 培養管及載玻片分別放置在達安760 實時熒光定量PCR 儀（生產企業為中山大學達安公司）中。按照中國防癆協會制定的《結核病細菌學檢驗規程》，對陽性菌株進行菌種鑒定[6]。根據《痰涂片鏡檢質量保證手冊》的要求，對采用直接涂片染色法、濃縮涂片染色法進行病原體檢測的結果進行判定。按照結核分歧桿菌核酸擴增熒光檢測試劑說明書的要求，對采用Real-time PCR技術聯合濃縮涂片染色法進行病原體檢測的結果進行判定。根據BACTEC MGIT-960 全自動分歧桿菌培養系統出具的陽性報告，對陽性菌株進行菌種鑒定。

1.3 觀察指標

觀察采用BACTEC MGIT-960 培養法、直接涂片染色法、Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法對這526份分泌物標本進行病原體檢測的時間、結核分枝桿菌的檢出率及用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法診斷結核病的靈敏度、特異度及準確率。敏感度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%。特異度=真陰性例數/（真陰性例數+ 假陽性例數）×100%。準確率=（真陽性例數+真陰性例數）/（真陽性例數+真陰性例數+假陽性例數+假陰性例數）×100%。

1.4 統計學處理

對本次研究中的數據均采用SPSS 21.0 統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 采用不同的方法對526 份分泌物標本進行病原體檢測的情況

與采用直接涂片染色法相比，采用MGIT-960 培養法、Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標本進行病原體檢測時結核分枝桿菌的檢出率更高，P＜0.05。與采用MGIT-960 培養法相比，采用直接涂片染色法、Realtime PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標本進行病原體檢測的時間更短，P＜0.05。詳見表1。

表1 采用不同的方法對526 份分泌物標本進行病原體檢測的情況

2.2 采用Real-timePCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法診斷結核病的靈敏度、特異度及準確率

采用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法對526 份分泌物標本進行病原體檢測的結果顯示，真陽性患者有140 例，真陰性患者349 有例，假陽性患者有21 例，假陰性患者有16 例。采用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法診斷結核病的靈敏度、特異度、準確率分別為89.7%、94.3%、93.0%。詳見表2。

表2 采用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法診斷結核病的靈敏度、特異度及準確率（%）

3 討論

目前，臨床上常采用直接涂片染色法、BACTEC MGIT-960 培養法等對結核病患者的分泌物標本進行病原體檢測。采用直接涂片染色法對結核病患者的分泌物標本進行病原體檢測具有簡便快捷、檢查費用低的特點。但用此法對結核病患者病情進行診斷的敏感度、特異度均較低。在臨床上，采用BACTEC MGIT-960 培養法進行病原體檢測的結果是診斷結核病的金標準。有研究表明，采用BACTEC MGIT-960 培養法對結核病患者病情進行診斷的效率較低，患者需要等待1 ～2 個月才能夠得到檢查的結果[7]。近年來，分子生物學技術被廣泛地應用于結核病的快速診斷中[8]。Real-time PCR 擴增技術基于TaqMan 熒光探針原理，可通過檢測熒光信號的強弱計算PCR 產物的數量。濃縮涂片染色法具有可直接觀察到抗酸桿菌的特點。陳昕昶等[9]的研究表明，采用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法對結核病患者的分泌物標本進行病原體檢測，既可簡化檢驗的流程，又可大大地縮短進行檢測的時間。

綜上所述，用Real-time PCR 擴增技術聯合濃縮涂片染色法可快速對結核病患者的病情進行診斷，且準確率較高。