基于孟德爾隨機化分析的飲酒與缺血性腦卒中PSCI因果關聯研究

蔡 奔，劉 婷，高 潔，肖莉萍，施恒遠，丁言穩，賈賢杰，于 影

缺血性腦卒中作為腦卒中常見的一種類型，占所有腦卒中病例的60%～70%。缺血性腦卒中是世界范圍內導致腦卒中病人死亡和致殘的主要原因之一，而且缺血性腦卒中后很大可能出現的認知功能障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI) 嚴重影響卒中病人的生活質量，卒中后PSCI已成為當前國際卒中研究和干預的熱點[1]。缺血性腦卒中的流行是遺傳易感性和眾多血管危險因素協同作用的結果[2]，但是對于缺血性腦卒中后PSCI，近年來相關性研究較少。孟德爾隨機化方法(Mendelian randomisation，MR)是運用孟德爾獨立分配定律，將不同基因型導致不同的中間表型(即待研究的相關暴露因素)，用基因-疾病的因果鏈來推導暴露因素對疾病的作用，計算出暴露因素對疾病或其他結局的真實效應值。近30年來，MR在心腦血管疾病領域的病因預測開發中發揮了舉足輕重的作用[3]。

線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)是代謝乙醛和多種有毒醛的重要酶。在ALDH2 rs671位點G突變為A的基因突變個體中，ALDH2酶活性嚴重降低，在東亞人中尤為明顯[4]。越來越多的流行病學調查[5]顯示，ALDH2基因多態性與心血管危險因素和腦卒中發病率的增加密切相關。來自實驗研究的證據也表明，ALDH2有助于活性醛的清除，并縮小腦梗死的范圍，改善卒中后神經功能損傷狀態，有利于病人預后[6]。因此，本研究擬通過工具變量如飲酒代謝強相關基因ALDH2 rs671的改變探究飲酒相關暴露因素如飲酒史和飲酒是否臉紅等變量對缺血性腦卒中PSCI影響的因果關系，為缺血性腦卒中后PSCI的預防和治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2018年7月至2019年1月蚌埠醫學院第一附屬醫院神經內科收治的缺血性腦卒中病人納入本研究。研究獲得了蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會的批準，符合赫爾辛基宣言。所有參與者或其親屬提供書面知情同意，納入標準：(1)年齡18～90歲；(2)入院時通過計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)證實缺血性腦卒中的診斷；(3)病人有能力和意愿簽署知情同意書。排除標準：(1)原發性出血性腦卒中或短暫性腦缺血發作；(2)任何中樞神經系統疾病如腦卒中前癡呆或帕金森氏病；(3)嚴重失語或構音障礙，視覺或聽覺障礙及急性或慢性炎癥性疾病病人。

1.2 方法

1.2.1 臨床變量和評估 通過課題組前期制定的標準化問卷采用面對面訪談收集人口學和臨床特征信息。人群一般特征信息調查包括年齡、性別、種族和教育水平，其他臨床資料包括腦梗死種類(按照OSCP分型)、飲酒狀況(曾經飲酒為過去任何時候飲酒量≥1標準杯，現飲酒為過去30 d內至少有一次飲酒量≥1標準杯[7])等。病人的認知功能用蒙特利爾認知評估(MoCA)量表評估。MoCA量表有30項測試，評估以下7個認知領域：視覺空間/執行功能、命名、記憶、注意力、語言、抽象和方向。MoCA量表已被翻譯成中文，并被驗證為中國人群PSCI和癡呆的篩查工具[8]。量表評分均按標準執行，MoCA量表總分30分，得分<26分為PSCI[9-10]。

1.2.2 實驗室檢測方法 在病人簽署知情同意書后，抽取空腹靜脈血5 mL左右，一管血含抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)，防止其在運送過程中凝血，利用Tiangen血液基因組DNA提取試劑盒(貨號：DP348-02)用于提取血液基因組DNA；另一管血為不含EDTA的生化檢測管，其作用是分出血清進行酶聯免疫吸附法(ELISA)測定病人血清中4-羥基壬烯醛(4-HNE)的水平。

1.2.3 基因型測定方法 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增目標序列：從血液中提取的基因組DNA，經過酶標儀測得質量濃度20 ng/μL以上,純度用OD260/OD280表示，數值在1.7～1.9之間為純度合格，PCR擴增目標序列，目標序列中含有所研究的ALDH2 rs671基因位點，體系共50 μL，其中50 ng的DNA樣本、2 μL上游產物和2 μL下游產物(上海生工公司合成)、25 μL PCR Master Mix(2X)(thermo scientific公司，Lithuania，K0171)、其余用ddH2O或DEPC水配到50 μL。PCR反應體系經課題組前期文獻研究及驗證確定為：預變性95 ℃ 3 min、變性 95 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 1 min、變性到延伸共40個循環，最后延伸72 ℃ 10 min、4 ℃保存半個小時以穩定反應產物。結束后經1%瓊脂糖凝膠，125 V，30 min電泳，電泳結果經凝膠成像系統鑒定。

純化PCR產物及基因序列測定：經過PCR擴增的DNA產物經過Tiangen普通DNA產物純化試劑盒(DP204-02)純化后，測定得出目標序列的正向堿基對序列，經過Gene Bank中找到的ALDH2 rs671位置附近的序列及引物序列核對，根據位置所處的峰值顯示，最終確定ALDH2的基因型。

1.3 MR基本原理的3個假設 MR基本原理的三個假設：(1)遺傳變異G與暴露或中間表型X有關；(2)除了通過暴露或中間表型X外，遺傳變異G與結果Y無關；(3)遺傳變異G與已知或未知的混雜因素C無關。

1.4 統計學方法 采用逆方差加權法(IVW)、方差分析、Hardy-Weinberg平衡分析、二元logistic回歸分析。

2 結果

2.1 PSCI與非PSCI病人的人口學特征和臨床特征 將131例病人按照MoCA量表26分劃分標準分為PSCI組94例和非PSCI組37例，文化程度、飲酒后是否臉紅和是否有飲酒史對病人PSCI的影響具有統計學意義(P<0.05)。缺血性腦卒中有部分前循環梗死24例(18.32%)、腔隙性腦梗死71例(54.20%)、后循環梗死36例(27.48%)，PSCI分組中梗死類型分布的差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 缺血性腦卒中PSCI的一般人群特征(n)

分組n腦梗死類型部分前循環梗死 腔隙性腦梗死 后循環梗死 飲酒史不飲酒 曾經飲酒 現在飲酒 飲酒是否臉紅經常 偶爾 不臉紅 飲酒種類白酒 紅酒 啤酒 PSCI組941749285619191926493511非PSCI組37722815715225102111χ2—0.926.0219.030.25P —>0.05 <0.05<0.05>0.05

2.2 實驗室檢測結果 從病人全血中提取DNA濃度為(54.88±20.59)ng/μL，純度(OD260/OD280)均在1.7～1.9之間，通過ALDH2 rs671位點的多態性決定其基因型，其中G突變為A，野生GG型76例，突變雜合AG型52例和突變純和AA型3例，該基因位點經過Hardy-Weinberg 遺傳平衡定量分析顯示具有恒定性(P>0.05)(見表2)。

表2 ALDH2 rs671基因的Hardy-Weinberg遺傳平衡分析結果

2.3 ALDH2不同基因型相關變量的比較 ALDH2各基因型MoCA得分差異經過單因素方差分析發現不具有統計學意義(P>0.05)，根據ALDH2基因型分組分析病人調查問卷中相關變量，發現相關協變量(如性別，年齡和梗死類型等)中ALDH2基因型的分布差異不具有統計學意義(P>0.05)，說明該工具變量ALDH2基因與一些協變量無關，而對于各ALDH2基因型分組的血清4-HNE濃度的差異經過單因素方差分析發現具有統計學意義(P<0.05)，飲酒暴露相關變量如飲酒史情況和飲酒后是否臉紅等變量，對ALDH2基因型野生型和突變型分布的影響具有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 ALDH2不同基因型相關變量的比較

2.4 飲酒相關暴露與缺血性腦卒中PSCI的因果關系分析結果 將上述符合MR假設的ALDH2基因型與飲酒后是否臉紅及飲酒史納入MR，進一步利用ALDH2基因型作為工具變量分析飲酒相關暴露因素與缺血性腦卒中PSCI之間的效應值(見表4)。因此有飲酒史與PSCI之間的因果關系值βIVW有飲酒史=βXY有飲酒史=0.606(OR=3.334，95%CI：3.038～3.653)；飲酒后臉紅與PSCI之間的因果關系值為βIVW臉紅=βXY臉紅=0.320(OR=4.908，95%CI：4.739～6.475)。

表4 ALDH2基因對PSCI和飲酒相關暴露因素的多因素分析結果

3 討論

有研究[11]表明ALDH2基因第12外顯子中常見的功能單核苷酸多態性(SNP)是缺血性腦卒中的危險指標，SNP是基因組中存在的最豐富和最穩定的遺傳變異。本研究對酒精代謝強相關基因ALDH2 rs671位點基因型進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗得差異無統計學意義(P>0.05)，說明本研究人群樣本具有區域群體代表性[12]。本研究滿足MR因果分析原理的3個基礎假設，即遺傳工具變量與暴露或中間表型有關，通過ALDH2基因野生型和突變型之間飲酒相關暴露因素分析，發現飲酒暴露因素中飲酒史和飲酒是否臉紅與ALDH2基因型的差異具有統計學意義(P<0.05)；除了通過暴露或中間表型外，遺傳變異與結果無關，ALDH2基因型對缺血性腦卒中認知功能是否損傷的差異不具有統計學意義(P>0.05)；遺傳變異與已知或未知的混雜因素無關，經過Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，ALDH2 rs671基因位點具有恒定性，不受妊娠和其他環境因素的影響。研究發現是否具有飲酒史與病人PSCI間的差異具有統計學意義(P<0.05)，證明飲酒是腦卒中的獨立危險因素，影響疾病的嚴重程度及預后轉歸[13]。在調整相關協變量后，采用二分類logistics回歸分析發現飲酒后臉紅是PSCI的危險性因素。MR分析飲酒相關暴露因素時發現飲酒后臉紅與PSCI之間的因果關系值為βIVW臉紅=βXY臉紅=0.320(OR=4.908，95%CI：4.739～6.475)，有飲酒史與PSCI之間的因果關系值為βIVW有飲酒史=βXY有飲酒史=0.606(OR=3.334，95%CI：3.038～3.653)，顯示有飲酒史及飲酒后臉紅與缺血性腦卒中后PSCI之間存在因果關系，即有有飲酒史和飲酒后臉紅是PSCI的危險因素，相關飲酒暴露如飲酒或飲酒后臉紅會增加缺血性腦卒中PSCI的危險性。

本研究是基于MR分析原理來探究飲酒相關暴露與缺血性腦卒中病人PSCI的因果關系，利用與飲酒代謝強相關基因ALDH2基因作為工具變量來分析飲酒暴露與病人PSCI之間的因果關系。最終結果顯示，有飲酒史和飲酒后臉紅是缺血性腦卒中PSCI的危險因素，相關飲酒暴露如飲酒或飲酒后臉紅會增加PSCI的發生概率(OR>1，95%CI均>1)。此結果提示缺血性腦卒中病人入院前有飲酒史和喝酒后臉紅是導致病人PSCI的重要危險因素，在健康人群或高危人群中倡導減少酒精的攝入，喝酒后臉紅病人盡量減少飲用酒精或者不喝酒，能夠有效地降低缺血性腦卒中PSCI的發生風險，其機制可能與人體在飲酒后，機體內酒精不能及時、完全代謝消除時，易產生一些有毒的醛類和一些自由基，引起正常膜結構功能的破壞，造成皮下一些微血管的破裂，引起酒后臉紅，酒精的代謝產物還能與腦組織中的卵磷脂結合，會直接損傷腦內神經細胞。大腦中的腦白質由神經纖維聚集而成，參與執行、注意、記憶以及視覺空間等腦功能活動，而大腦完整的白質連接是維持正常認知功能的結構基礎[14]。酒精及其一些代謝產物的神經毒性均可降低神經元活動，干擾神經遞質的釋放與表達。酒精通過以上作用機制造成病人學習記憶等PSCI[15]。

本研究首次基于孟德爾隨機化分析方法研究飲酒暴露與缺血性腦卒中PSCI間的因果關系，發現缺血性腦卒中病人入院前有飲酒史和飲酒后臉紅與其PSCI間存在正向因果關聯。但本研究人群中完全前循環梗死病人出現完全大腦中動脈綜合征即三偏癥、意識障礙和失語，無法完成問卷調查。其次一些調查者拒絕參與抽血檢測，導致部分抽樣偏倚。其次是利用MR和橫斷面調查資料進行因果推斷，雖然MR研究對生物標志物與缺血性腦卒中PSCI的因果關系提供了大量證據，但這方面依托的隊列研究較少，是進一步研究的方向。最后，ALDH2等位突變基因是缺血性腦卒中的重要危險因素，但不同民族、不同國家和不同地區的研究結果不完全一致，對于不同人群的基因研究還需進一步綜述和論證。