高親合力抗雙鏈DNA抗體對系統性紅斑狼瘡的診斷價值

歐陽芬，張喬軒，李妙言，柯培鋒，何 敏

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種臨床表現為免疫炎癥的彌漫性結締組織病，以血清中出現多種自身抗體和免疫復合物為特點?？闺p鏈DNA抗體(anti-dsDNA antibody，抗dsDNA抗體)是SLE的特異性抗體，對SLE的特異性可達85%以上，被納入美國風濕病學會11項SLE診斷標準?？筪sDNA抗體陽性不僅見于SLE病人(70%～95%)，也與很多其他自身免疫性疾病有關，如藥物誘導性紅斑狼瘡(60%)、混合性結締組織病(20%～50%)、多肌炎/皮肌炎、硬皮病等,極少情況下出現于健康人群[1]。

目前臨床實驗室有多種方法可以檢測抗dsDNA抗體[2-5]，如放射免疫法(radioimmunoassay，RIA法)、間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)、免疫印跡法(immunoblotting，IBT)、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等。

本實驗所采用的尿素洗脫抗體親合力測定方法正是以ELISA方法為基礎，依據抗原抗體復合物在不同鹽離子濃度下解離程度不同，高親合力的抗體其空間構象與抗原位點更吻合、結合更緊密，因而在相同鹽離子濃度下更難洗脫的原理，通過檢測洗脫完畢后抗原抗體復合物的A值來得到高親合力抗dsDNA抗體水平[6]。本研究旨在探討抗dsDNA抗體和高親合力抗dsDNA抗體在SLE病人中的分布情況以及與其他指標之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年8月至2018年4月廣東省中醫院就診的抗dsDNA抗體陽性的血清標本共155例。SLE病人116例，其中男7例，女109例；男女比例為1∶16，平均36歲。所有病人均符合2017年美國風濕病學會與歐盟抗風濕病聯盟年補充及修訂的SLE診斷標準[7]。非SLE組39例，其中男8例，女31例；男女比例為1∶4，平均33歲。所有樣本取空腹靜脈分離血清，于-80 ℃保存。本研究經廣東省中醫院倫理委員會批準(倫理號：ZE2019-206)。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 IIF法檢測總抗dsDNA抗體(dsDNA-IIF) 采用德國歐蒙公司的熒光試劑，以綠繩短膜蟲為包被抗原，以異硫氰酸熒光素( fluoresceinisothiocyanate,FITC)標記的羊抗人IgG為熒光二抗，對所有標本進行IIF檢測，以抗dsDNA抗體IIF<1∶10判為陰性，IIF≥1∶10判為陽性。

1.2.2 ELISA法檢測抗dsDNA抗體 ELISA法檢測總抗dsDNA抗體(dsDNA-ELISA)：采用德國Euroimmun公司生產的抗dsDNA ELISA試劑盒(Lot No.E170720AM)進行檢測，實驗操作嚴格按照產品說明書進行，以抗dsDNA抗體 ELISA<100 IU/mL判為陰性；ELISA≥100 IU/mL判為陽性。

ELISA檢測高親合力抗dsDNA抗體：在ELISA檢測的基礎上，在二抗溫育步驟前增加6 mol/L尿素緩沖液溫育微孔板半個小時后洗板，其余步驟同ELISA檢測總抗dsDNA抗體檢測。測出高親合力抗dsDNA抗體水平。

1.3 統計學方法 采用χ2檢驗、秩和檢驗、Kappa分析和Spearman相關性分析。檢測方法間的符合率計算根據CNAS-GL038《臨床免疫學定性檢驗程序性能驗證指南》、方法間一致性評價用Kappa分析，Kappa>0.75表示好的一致性(Kappa最大為1),<0.4表示一致性差。

2 結果

2.1 樣本人群的基本特征及2種方法檢測結果的情況 SLE多發生于中年女性病人，SLE組女性比例高于非SLE組(P<0.05)，2組的年齡差異無統計學意義(P>0.05)。SLE組的dsDNA-IIF陽性率和dsDNA-ELISA陽性率均高于非SLE組，差異均有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 樣本人群的基本特征及2種方法檢測結果的情況

2.2 dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA檢測結果的符合率與一致性 dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA檢測結果之間存在不一致。在SLE組中，dsDNA-IIF陽性78例、陰性38例，dsDNA-ELISA陽性99例、陰性17例，兩者結果不一致共49例，在不一致中，SLE組dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的例數為35例、dsDNA-IIF陽性、dsDNA-ELISA陰性的例數為14例。非SLE組中dsDNA-IIF 39例全部為陰性，dsDNA-ELISA陽性15例、陰性24例，說明dsDNA-ELISA檢測結果特異性不高。dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA的總體符合率為58.7%(91/155)，陽性符合率為56.1%(64/114)，陰性符合率為65.9%(27/41)。在不一致中，IIF法陰性、ELISA法陽性占32.3%(50/155)，IIF法陽性、ELISA法陰性占9.0%(14/155)。主要以弱陽性總抗dsDNA抗體ELISA 100～300 IU/mL或IIF1∶10為主，分別占47.3%(26/55)、34.1%(14/41)(見表2)。經檢驗Kappa=0.172 <0.4，說明2種方法的一致性較低(P<0.01)。

表2 dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA結果的分布情況

2.3 dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的符合率與一致性 dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體結果之間存在不一致，在SLE組中，高親合力抗dsDNA抗體陽性81例、陰性35例，dsDNA-ELISA陽性99例、陰性17例；在非SLE組中，高親合力抗dsDNA抗體陽性8例、陰性31例，dsDNA-ELISA陽性15例、陰性24例，SLE組dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的差異有統計學意義(χ2=14.34，P<0.01)。dsDNA-ELISA、高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率為77.4%(120/155)，陽性符合率為73.7%(84/114)，陰性符合率為87.8%(36/41)。dsDNA-ELISA和高親合力抗dsDNA抗體均>100 IU/mL中SLE組占91.7%(77/84)。在不一致中，dsDNA-ELISA陰性、高親合力抗dsDNA抗體陽性占3.2%(5/155)，dsDNA-ELISA陽性、高親合力抗dsDNA抗體陰性占19.4%(30/155)(見表2)。經檢驗Kappa=0.514，0.4

表3 dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體結果的分布情況

2.4 dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的符合率與一致性 在SLE組中，dsDNA-IIF陽性78例，陰性38例；在非SLE組中，dsDNA-IIF陽性0例，陰性39例。dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率為61.9%(96/155)，陽性符合率為61.3%(54/88)，陰性符合率為63.6%(42/66)。在不一致中，dsDNA-IIF陰性、高親合力抗dsDNA抗體陽性占22.6%(35/155)，IIF法陽性、高親合力抗dsDNA抗體陰性占15.5%(24/155)。主要以高親合力抗dsDNA抗體>300～600 IU/mL、IIF 1∶10為主，分別占42.9%(18/42)、28.6%(22/77)。經檢驗Kappa=0.247 <0.4，說明兩種方法的一致性較低(P<0.01)(見表4)。如果將dsDNA-IIF和高親合力抗dsDNA抗體聯合診斷，則診斷敏感率為90.5%(105/116)，特異性為100%(39/39)。

表4 dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的符合率

2.5 高親合力抗dsDNA抗體水平與其他指標之間的相關性 高親合力抗dsDNA抗體水平與dsDNA-IIF和dsDNA-ELISA水平呈正相關(P<0.01)，與性別、年齡、是否是狼瘡腎炎無相關性(P>0.05)(見表5)。

表5 高親合力抗dsDNA抗體水平與其他指標之間的相關性

3 討論

SLE是一種常見的、累及全身的自身免疫性疾病，2017年美國風濕病學會與歐盟抗風濕病聯盟年補充及修訂的SLE診斷標準中規定，在病人病情發展的任何階段，只要11條診斷標準中出現4條即可診斷SLE，其中實驗室檢查抗dsDNA抗體陽性獨立成為一條，這足以說明血清抗dsDNA抗體檢測對于SLE診斷的重要性。然而，標準中并未就抗體的檢測方法進行限定，但正是不同的檢測方法和不同的試劑影響著特定實驗的結果解釋。

現在普遍建議聯合檢測抗雙鏈DNA抗體，以高通量、敏感性較高的ELISA作為抗dsDNA抗體的初篩實驗，減少對穩定期SLE的漏診率；用特異度較高的IIF復查，減少假陽性和假陰性的發生[8]。當這兩種方法出現不一致的時候，就會產生疑惑。有研究數據顯示，不一致中以IIF陰性ELISA陽性居多。而這種不一致更多地指向抗體地親合力[9]?？贵w的親合力是表征特異性抗體性質的重要指標，反映抗原抗體結合的強度。目前根據被檢測抗體與抗原dsDNA的結合和解離的特性(Kon/Koff)來界定抗dsDNA抗體的親合力高低。具有高解離常數的抗dsDNA抗體為高親合力抗dsDNA抗體。

dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體，dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA兩組都存在檢測結果不一致的情況。在dsDNA-IIF、dsDNA-ELISA的非SLE組不一致中，只出現了dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的情況，表明dsDNA-ELISA對SLE的特異性不高。dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的原因可能在于 ELISA檢測方法的局限。ELISA檢測方法中DNA的內部結構位點人為暴露、變性解鏈成ssDNA，引起非特異性反應，導致檢測結果假陽性較多。其次 ELISA的抗原需先通過多聚L賴氨酸或魚精蛋白等介質包被在聚乙烯板上，往往會引起免疫復合物或非特異性免疫球蛋白等物質交叉反應出現假陽性。而對于dsDNA-IIF陽性dsDNA-ELISA陰性可能由于 ELISA法在抗原包被過程中抗原位點被遮蔽等導致 ELISA檢測為假陰性。

在dsDNA-IIF、高親合力抗dsDNA抗體檢測結果的不一致中，dsDNA-IIF陰性、高親合力抗dsDNA抗體陽性占22.6%(35/155)低于dsDNA-IIF陰性、dsDNA-ELISA陽性的32.3%(50/155)，表明dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的聯合診斷有利于降低假陽性率。

dsDNA-ELISA和高親合力抗dsDNA抗體檢測結果>100 IU/mL中SLE組占91.7%(77/84)，dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的聯合診斷有利于提高總抗dsDNA抗體的真陽性率。疾病對照組dsDNA-ELISA陽性、高親合力抗dsDNA抗體陰性占總例數的3.2%(5/155)。dsDNA-ELISA與高親合力抗dsDNA抗體的聯合診斷有利于降低總抗dsDNA抗體的假陽性率。dsDNA-IIF、高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率為61.9%(96/155)高于dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA的總體符合率58.7%(91/155)。dsDNA-IIF、高親合力抗dsDNA抗體的Kappa值為0.247大于dsDNA-IIF、dsDNA-ELISA的0.172，二者的P值均<0.01。從數據分析可得，dsDNA-IIF與高親合力抗dsDNA抗體的總體符合率和一致性都大于dsDNA-IIF與dsDNA-ELISA。dsDNA-IIF聯合高親合力抗體水平診斷相對于dsDNA-IIF和dsDNA-ELISA聯合診斷更有助于對SLE的診斷。另外，研究發現SLE女性病人居多，查閱文獻分析可能的原因是由于女性的雌激素和泌乳素高而導致女性多發。實驗數據顯示高親合力抗體與性別無相關性。SLE病人是否又是狼瘡腎炎病人與高親合力抗dsDNA抗體無關，有待進一步研究。