黃芪甲苷通過抑制MerTK緩解阿霉素引起的心臟毒性

王雪麗，陳亞男，黃厚芹，劉岳鵬，許 瑾，何學明

腫瘤發病率逐年升高[1]，化療作為一種強而有效的治療手段被廣泛應用于腫瘤治療。阿霉素作為一種高效、廣譜的蒽環類抗癌藥，可用于治療成人以及兒童的多種實體腫瘤(如乳腺、卵巢和胃腸道腫瘤)和血液惡性腫瘤(如淋巴瘤和白血病)，然而，因阿霉素可引起劑量依賴性的心臟毒性，導致嚴重心肌病和充血性心力衰竭，嚴重限制了其在臨床上的應用[2]，因此老年腫瘤病人及有嚴重心臟病者屬限制性用藥，克服阿霉素的心臟毒性將有助于擴寬阿霉素的適用人群。

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ)是中藥黃芪主要的有效成分，具有抗癌、抗氧化、抗老化、抗炎等多種效應[3]。AST Ⅳ具有明顯的心臟保護作用，主要表現為抑制心臟重構、改善血管內皮細胞功能、保護心肌缺血以及抑制心肌細胞凋亡等[4]。已有研究[5]表明，AST Ⅳ能緩解柯薩奇病毒B3感染引起的以嚴重的心臟炎癥為特征的病毒性心肌炎。AST Ⅳ的心臟保護作用的機制尚不明確。Mer酪氨酸激酶(Mer tyrosine kinase，MerTK)是TAM受體酪氨酸激酶家族成員之一。MerTK缺乏已被證明在動脈粥樣硬化模型中是有害的，因為它具有抑制炎癥，促進分解和驅動斑塊壞死核心中凋亡小體清除的能力[6]。我們的預實驗提示AST Ⅳ能夠維持MerTK的水平，因此提出假說，AST Ⅳ可能通過抑制MerTK裂解從而緩解阿霉素引起的心肌損傷。本研究旨在探究AST Ⅳ對阿霉素誘導的心肌損傷的保護作用，以及MerTK是否在其中發揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性6周齡ICR小鼠(18～22 g)，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。鹽酸多柔比星購自深圳萬樂藥業有限公司，AST Ⅳ購自成都曼斯特有限公司，羧甲基纖維素鈉購自上海生物工程有限公司，Masson染色試劑盒購自福建邁新公司，p-MerTK抗體購自Abcam公司，白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。小動物心電圖機(BL-420S生物機能實驗系統)，AU5800型全自動生化分析儀(美國BeckmanCoulter公司)。

1.2 實驗動物 50只小鼠隨機分成對照組、阿霉素組(DOX組)、DOX+AST Ⅳ20 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ40 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組，每組10只，觀察小鼠精神狀態和存活率改善情況以進行AST Ⅳ劑量的篩選。隨后，30只小鼠隨機分為對照組、DOX組、DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組，每組10只。給予ICR小鼠阿霉素20 mg/kg單次腹腔注射制備阿霉素急性心臟毒性模型，對照組給予0.9%氯化鈉溶液。將AST Ⅳ用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成2 mg/mL混選液，給予小鼠灌胃，對照組與DOX組給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。于造模前1 d給予AST Ⅳ 80 mg/kg灌胃預處理，造模當天記為第0天，繼續給藥10 d，每天1次。

1.3 心電圖監測、高分辨率小鼠超聲監測心功能 于造模后第10天，每組各取3只，給小鼠備皮，運用氣麻機麻醉小鼠(麻醉藥為異氟烷)，將小鼠放置于檢測臺上。四肢涂抹導電凝膠，心電圖機監測小鼠心電圖，高分辨率小鼠超聲監測心臟射血分數(EF)和縮短分數(FS)。

1.4 心臟Masson染色 于造模后第10天，每組各取3只，迅速暴露小鼠心臟，用40 g/L多聚甲醛經左心室灌注，心固定24 h后，加入400 g/L蔗糖脫水，冰凍切片，Masson染色(參照試劑盒說明書)，顯微鏡下觀察。

1.5 血液樣品制備 于造模后第10天，每組各取3只，收集小鼠靜脈血，每只500～600 μL，冰上靜置后放入4 ℃離心機中，3 000 r/min離心10 min，分離上清。使用全自動血清生化儀檢測血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量(試劑盒購自浙江伊利康生物技術有限公司)；通過酶聯免疫吸附法測定IL-1β、IL-6和TNF-α水平(試劑盒購自碧云天生物技術有限公司)。

1.6 組織蛋白樣品制備以及心臟組織MerTK蛋白表達的檢測 于造模后第10天，每組各取3只，用40 g/L水合氯醛0.4 mL/20 g麻醉并處死小鼠，用眼科剪開胸取心，將其放入預冷PBS中，將心臟中的血液輕輕擠壓漂洗干凈血液，用濾紙吸干水份。心臟組織置于凍存管后，存放于液氮中速凍。將樣本移入專用組織破碎管中，每10 mg樣本中加入100 μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，并放入適量磁珠，放入破碎儀中勻漿2～3次，直到組織塊消失。冰上靜置1 h，待組織樣本充分裂解。使用預冷的4 ℃離心機，15 000 r/min離心10 min。取上清液，并且用BCA法測蛋白濃度。放入-80 ℃備用。蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混合，渦旋混勻，100 ℃水浴中加熱5 min。每個泳道加30 μg蛋白樣品，通過SDS-PAGE分離蛋白質，并電泳轉印至PVDF膜上，室溫封閉60 min，加入按1∶1 000稀釋的p-MerTK抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜后再以辣根過氧化物酶標記的兔源IgG室溫孵育2 h。ECL底物發光顯色1 min，應用Image J軟件對條帶進行灰度分析，目的蛋白條帶和內參GAPDH條帶的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 小鼠一般情況與存活率 對照組小鼠精神狀態良好，進食情況正常；DOX組、DOX+AST Ⅳ 20 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ 40 mg/kg組出現精神萎靡不振、中度腹瀉等癥狀；DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠精神狀態尚可，有輕度腹瀉的癥狀。造模第10天，對照組小鼠存活10只，DOX組小鼠存活3只，DOX+AST Ⅳ 20 mg/kg組小鼠存活3只，DOX+AST Ⅳ 40 mg/kg組小鼠存活4只，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠存活6只。DOX組小鼠死亡率高；DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組第10天小鼠存活率明顯改善；DOX+AST Ⅳ 20 mg/kg組、DOX+AST Ⅳ 40 mg/kg組第10天小鼠存活率低，且精神狀態欠佳。因此，其他實驗中AST Ⅳ劑量為80 mg/kg。

2.2 AST Ⅳ改善阿霉素引起的心電圖異常 與對照組相比，DOX組小鼠心率明顯減慢、QT間期明顯延長(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80mg/kg組小鼠QT間期明顯縮短(P<0.01)，心率改善幾乎達到正常水平(見表1)。

表1 AST Ⅳ改善阿霉素引起的小鼠心電異常

2.3 AST Ⅳ改善阿霉素引起的超聲心動圖異常 與對照組相比，DOX組小鼠EF和FS均明顯降低(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠EF、FS下降程度明顯改善(P<0.01)(見表2)。

表2 3組小鼠心臟超聲心動圖檢查結果

2.4 AST Ⅳ改善阿霉素引起的心肌酶改變 與對照組相比，DOX組CK-MB和LDH含量均明顯增加(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組CK-MB和 LDH含量均明顯降低 (P<0.01)(見表3)。

表3 AST Ⅳ改善阿霉素引起的心肌酶改變

2.5 心肌形態學Massson染色結果 Massson染色結果顯示，與對照組相比，DOX組小鼠心肌細胞間質出現嚴重纖維化(藍色部分)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組小鼠心肌纖維化面積明顯減少(藍色部分)(見圖1)。

2.6 AST Ⅳ通過抑制MerTK裂解緩解阿霉素引起的心臟毒性 與對照組相比，DOX組p-MerTK的蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組p-MerTK的表達水平明顯下降(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 各組p-MerTK蛋白表達比較

2.7 AST Ⅳ緩解阿霉素引起炎癥 與對照組相比，DOX組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)；與DOX組相比，DOX+AST Ⅳ 80 mg/kg組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯下降(P<0.01)(見表5)。

表5 各組炎癥指標水平比較

3 討論

蒽環類化療藥物阿霉素顯著提高了癌癥病人的生存率；但是，許多病人遭受阿霉素引起的心臟毒性，以劑量依賴性方式引起不可逆性心肌病，如左心功能不全和心力衰竭，降低了病人的生存質量[7]。右丙亞胺是FDA批準用于治療阿霉素誘導的心臟毒性的唯一藥物，然而其也具有很大的不良反應，如骨髓抑制和干擾阿霉素活性[8]。因此，尋找緩解化療性心臟病新的治療方案極其迫切。本研究顯示在給予化療藥物后，給予AST Ⅳ可以減輕化療藥物導致的心臟毒性，且與MerTK的作用相關，為臨床緩解化療藥物毒性提供了新的選擇。

AST Ⅳ可以減輕阿霉素引起的心臟損傷，減輕心臟炎癥并改善心功能。通過查閱文獻，本研究選擇20、40、80 mg/kg 3個AST Ⅳ劑量[9-10]，然而在小鼠生存率實驗中，20、40 mg/kg AST Ⅳ組小鼠死亡率未明顯改善，因此選擇80 mg/kg AST Ⅳ進行其他實驗。相關文獻[9-10]也顯示，大劑量的AST Ⅳ才是有效的，大劑量的AST Ⅳ能夠減輕心肌損傷、心肌炎癥、心肌細胞凋亡、心臟纖維化等。研究[9]表明，AST Ⅳ能夠通過抑制NADPH氧化酶2和NADPH氧化酶4減輕阿霉素誘發的心肌細胞凋亡、心肌炎癥等；AST Ⅳ顯著減弱了阿霉素誘導的心肌細胞線粒體損傷和功能障礙[11]；AST Ⅳ通過抑制NF-κB信號轉導可減輕柯薩奇病毒B3感染引起的心肌炎的嚴重程度，并減輕心臟炎癥[5]。本研究也顯示AST Ⅳ減輕了阿霉素引起的IL-1β等炎癥指標的升高，明確了AST Ⅳ對抗心臟炎癥的作用。研究[4,9,12]表明，AST Ⅳ通過多種信號通路改善心臟的收縮功能，并發揮心肌保護作用，如抑制NADPH氧化酶衍生的氧化應激、抑制NF-κB信號轉導、激活PPARα，本研究顯示AST Ⅳ改善阿霉素引起的心臟收縮功能指標EF、FS的降低、心肌酶LDH、CK-MB的升高以及心肌纖維化。

AST Ⅳ減輕心臟損傷的機制可能是抑制了MerTK裂解。有研究[10]表明MerTK的裂解由TNF-α轉化酶通過涉及活性氧(ROS)、蛋白激酶Cδ和p38絲裂原活化蛋白激酶的途徑介導。另有研究[12]表明生長停滯特異性蛋白6(Gas6)和蛋白S是MerTK的配體，GAS6和蛋白S都是橋接分子，將MerTK與垂死細胞上的磷脂酰絲氨酸連接起來ADAM17裂解MerTK形成可溶性Mer。ROS是阿霉素引起的常見成分，它們誘導MerTK的蛋白裂解，導致MerTK功能障礙和穩定裂解產物可溶性Mer的出現[13]；MerTK裂解會損害炎癥消退并限制心臟修復[6]。抑制MerTK裂解可在缺血再灌注損傷后促進炎癥消退，促炎性介質IL-1β和TNF-α降低[6]。在心肌缺血再灌注小鼠模型中，巨噬細胞MerTk缺失導致心臟創傷清創減少，梗死面積增大，心功能下降，提示MerTK可能參與心肌修復[14]。本研究結果顯示，AST Ⅳ維持了MerTK表達水平的同時降低了阿霉素引起的炎癥介質IL-1β、IL-6和TNF-α升高，提示AST Ⅳ可能通過維持心肌組織內巨噬細胞的MerTK水平維持巨噬細胞清除炎癥的功能而實現其改善心功能和心肌纖維化的作用。