急性髓系白血病中RUNX1突變基因相關預后模型的構建

李 娟，馬 麗，張小晴，童 也，李玉云

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種以未成熟血液細胞分化障礙且浸潤其他器官或組織從而抑制骨髓造血功能為特點的造血祖細胞惡性增殖性疾病。目前臨床上仍是以傳統的蒽環類藥物和阿糖胞苷為基礎進行治療。近年來，AML病人的總體生存時間較以往雖然有所提高，但治療策略卻并未發生太大變化。目前，20～30歲AML病人的3年生存率大約只有30%，而對于>60歲的老年病人，5年生存率僅有5%左右[1]。AML病人治愈率低、預后差以及缺乏特異性藥物仍是目前臨床研究亟待解決的難題，因此，可靠的預后評估對治療策略至關重要。隨著對AML細胞遺傳學及基因改變的不斷認識，細胞及分子遺傳學異常逐漸被認為是影響AML預后的重要因素。常見基因突變如WTI基因突變，IDH1/2基因突變、FLT3和TET2基因突變都已被證實與AML病人的預后不良高度相關[2-5]。此外，在AML中，轉錄因子RUNX1 被檢測到發生突變的概率較大，早在2008就已被WHO作為AML特異性的分子標志進行單獨分類[6]。

RUNX1基因是RUNX家族成員之一，位于21號染色體長臂(21q22,12)，可與核心結合因子B(CBF)形成異二聚體復合物，并與DNA序列發生相互作用[7]。RUNX1基因作為造血過程中關鍵的調節因子，參與多種造血基因的表達調節，如粒細胞-巨噬細胞刺激因子[8],是人類白血病中多種染色體易位的常見靶點。RUNX1基因突變見于多種血液系統疾病，如急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合癥等，且RUNX1突變是AML病人預后不良的影響因素，RUNX1突變對AML病人總體生存率的下降具有重要意義[9-10]。本研究從RUNX1突變AML病人和RUNX1未突變AML病人樣本中找出差異基因，結合樣本對應的臨床信息，將全部的差異基因進行Cox回歸分析并進一步構建預后基因模型，以期為AML的臨床個體化治療、預后判斷及病情監測提供有價值的實驗依據。現作報道。

1 材料與方法

1.1 數據獲取 從美國國立生物技術信息中心(NBCI)的基因表達匯編(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫中下載數據集GSE37642以及其對應的平臺文件GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)。基于GPL96平臺的GSE37642數據集中共包含422個AML病人的組織樣本(骨髓單核細胞)，提取樣本對應的生存時間、生存狀態、是否發生RUNX1突變等臨床信息。

1.2 數據處理 將GSE37642的矩陣數據讀入R軟件中，通過平臺文件GPL96將表達矩陣的探針信息轉換為基因名。多個探針對應同一個基因名時取表達值最大的探針并對樣本表達值做標準化處理(log2對數轉換)。此外，將缺少RUNX1突變信息的樣本予以剔除，最終得到包含370個AML組織樣本的表達矩陣文件(59個RUNX1突變樣本，311個未突變樣本)。

1.3 差異表達分析 上述得到的表達矩陣文件，按照是否發生RUNX1突變將樣本分為2組，并通過Limma軟件包從2組樣本中篩選差異表達基因。Pvalue<0.05和差異倍數的絕對值(|log2(Fold Change)|)>0.7為差異基因的篩選條件。

1.4 預后基因模型的構建 從標準化的表達矩陣中提取全部差異基因的表達量，并與樣本對應的生存時間、生存狀態信息合并。將全部的差異基因進行單因素Cox回歸分析，并篩選出P<0.05的基因納入到后續的多因素Cox回歸當中。構建的多因素Cox回歸模型中，基于雙向逐步回歸法，對構建模型的基因進一步的篩選，并用得到的基因構建預后基因模型。

1.5 基因模型評估 根據基因模型的公式，計算每個樣本的風險評分，并按照中位數將樣本分為高風險評分組與低風險評分組。對2組樣本做生存分析并通過未來1、3、5年的ROC曲線對模型預測精度予以評估。

2 結果

2.1 差異表達基因 從RUNX1突變組與未突變組中共篩選得到89個差異基因，其中30個基因上調，有BIK、SMYD3、CCNA1、CRIP1等；59個基因下調，有SETBP1、DNTT、PTK2、APP等(見圖1)。

2.2 預后基因模型 基于樣本對應的生存信息，全部的差異基因通過單因素Cox回歸進行篩選，得到38個基因(見圖2)。采用38個基因構建多因素Cox回歸模型，并通過雙向逐步回歸法篩選得10個基因(見圖3)，包括BIK、APP、MLLT3、C10orf10、PLXNC1、FHL1、CST3、TGLL1、HOXA5、KIAAO125。使用該10個基因構建預后基因模型，風險評分公式為：風險評分=-0.100×(BIK)+0.215×(APP)+-0.232×(MLLT3)+0.112×(C10orf10)+0.160×(PLXNC1)+0.113×(FHL1)+ -0.167×(CST3)+ -0.152×(IGLL1)+ 0.164×(HOXA5)+ 0.084×(KIAA0125)。根據風險評分公式，其中BIK、MLLT3、CST3和IGLL1的風險比小于1，表明這些基因可能是AML預后保護因素。而其他6個基因的風險比大于1，提示這些基因可能是AML預后危險因素。預后基因模型的風險曲線(見圖4)。

2.3 預后基因模型 基于預后基因模型，對高、低風險評分組進行生存分析，結果表明高風險評分組的總體生存率顯著低于低風險評分組(χ2=14.03，P<0.01)(見圖5)；基于預后基因模型，采用ROC曲線對未來1年、3年和5年的總體生存率進行預測，結果表明，1年的AUC為0.709，3年的AUC為0.769，5年的AUC為0.771，提示構建的模型具有較好的預測能力。

3 討論

研究[11-12]發現，RUNX家族參與多種腫瘤的發生發展，如RUNX1在造血調控以及血液系統腫瘤的發生發展中起重要作用；RUNX2作為骨細胞的特異性轉錄因子，可參與骨骼發育與骨肉瘤的形成，RUNX3的缺失會導致實體瘤的形成[13-14]。RUNX1在造血調控以及血液系統疾病的發生發展中亦發揮重要作用，RUNX1能夠促進白血病細胞增殖發揮致癌作用[15]。本研究從NBCI的基因表達匯編數據庫中收集共包含422個AML病人的組織樣本，提取樣本對應的生存時間、生存狀態、是否發生RUNX1突變等臨床信息，將樣本分為RUNX1突變組和RUNX1未突變組，并通過Limma軟件包從2組樣本中篩選出89個差異表達基因，其中30個基因上調，有BIK、SMYD3、CCNA1、CRIP1等；其中59個基因下調，有SETBP1、DNTT、PTK2、APP等。基于樣本對應的生存信息，全部的差異基因通過單因素Cox回歸進行篩選，得到38個基因被納入到后續的多因素Cox回歸模型當中。基于雙向逐步回歸法，從38個基因中進一步篩選得到10個基因，包括BIK、APP、MLLT3、C10orf10、PLXNC1、FHL1、CST3、IGLL1、HOXA5、KIAAO125。上述10個基因被用來構建預后基因模型，并基于該模型得到每個病人的風險評分，其中BIK、MLLT3、CST3和IGLL1的風險比小于1，表明這些基因可能是AML預后保護因素。MLLT3是維持人類造血干細胞的一個重要調節因子[16]。而APP、C10orf10、PLXNC1、FHL1、HOXA5和KIAAO125這6個基因的風險比大于1，提示這些基因很有可能是AML預后的危險因素。近年來，APP(淀粉樣前體蛋白)的表達增加可促進AML1/eto陽性白血病細胞的增殖和遷移，同時提高了髓外浸潤的發生率，與AML病人的預后不良高度相關[17]。FU等[18]研究發現，高表達FHL1的AML病人其總體生存率和化療反應較對照組更差，而靶向干預FHL1的表達可以有效提高AML病人對阿糖胞苷的藥物敏感性。值得注意的是，高、低風險評分組的生存分析結果表明高風險評分組的總體生存率顯著低于低風險評分組。此外，通過ROC曲線對病人未來1、3和5年的總體生存率進行預測，結果表明AUC均大于0.7，這反映出我們構建的模型具有較好的預測能力。

本研究通過生物信息學工具篩選差異基因成功構建了預后模型，其中BIK、MLLT3、CST3和IGLL1可能是AML預后保護因素，APP、C10orf10、PLXNC1、FHL1、HOXA5和KIAAO125可能是AML預后的危險因素。鑒于我們的標本量少和部分病人年齡、體能狀態原因，我們建立的預后模型可能為AML今后的靶向治療及預后判斷提供新的方向，BIK、MLLT3、CST3等基因可能會成為RUNX1突變型AMl治療的新靶點。其具體機制仍需擴大病例樣本及結合細胞實驗后進一步明確。