二甲雙胍改善佐劑性關節炎大鼠骨破壞的作用和機制研究

陳笑天，宋宜寧，王 穎，周 靜，王 茜，司 悅，魏 芳

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是常見的自身免疫性疾病，骨破壞貫穿整個病程，是病人致殘的主要原因。RA骨破壞呈慢性進展性，以滑膜炎為主要病理變化，關節滑膜產生慢性持續性的炎癥和增生，形成血管翳，繼而侵犯關節軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成不可逆的骨破壞[1-2]。不僅嚴重影響病人生活質量，也為病人及其家屬帶來了極大的痛苦和經濟負擔，最終導致嚴重的社會問題。現代醫學研究[3-5]發現，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)信號通路及白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎細胞因子與RA骨破壞關系密切，相互介導著RA骨破壞的發生發展。目前，RA骨破壞仍大多數基于傳統的治療方案，包括非甾體類抗炎藥(NSAIDS)、抗風濕藥物(DMARDs)、糖皮質激素類藥物(GCS)及最新的生物治療。但由于NSAIDS、DMARDs、GCS等藥物長期服用有嚴重的不良反應，生物制劑價格高昂且療效需進一步證實，尤其是應用于活動性低的RA病人的臨床試驗中收效甚微[1,6]，這些都限制了RA骨破壞的治療。因此，尋找新的治療RA骨破壞的藥物仍然是臨床面臨的挑戰性問題。

近年來的研究[7-8]表明，二甲雙胍能夠抑制全身性炎癥，影響各種炎癥因子水平，通過多種途徑影響骨代謝，起到骨質保護作用，但具體機制尚不明確。并且針對二甲雙胍對RA導致的骨破壞的作用效果及相關機制研究以及二甲雙胍是否可以用于治療RA導致骨破壞等內容，學術界尚無定論。本研究通過建造動物模型，測定佐劑性關節炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠的整體指標、血清骨代謝指標、放射線檢查、關節病理免疫組織化學(免疫組化)等指標，探究二甲雙胍治療RA導致的骨破壞的效果及機制，為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 將10 mg/mL完全弗氏佐劑(complete freund adjuvant,CFA)充分混勻，于每只大鼠右后足跖皮下注射CFA 0.1 mL制備AA模型。2周后把建模成功的大鼠篩選出40只,每組8只，隨機分為模型組、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組(0.5 mg·kg-1·3 d-1)、二甲雙胍高劑量組(100 mg·kg-1·d-1)、二甲雙胍中劑量組(75 mg·kg-1·d-1)、二甲雙胍低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)。正常組用0.9%氯化鈉溶液同法灌胃給藥，給藥時間均持續30 d。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：CFA購自Chondrex Inc(USA)；二甲雙胍片(格華止)購自中美上海施貴寶制藥有限公司；MTX購自通化茂祥制藥有限公司。大鼠血鈣ELISA檢測試劑盒、大鼠血磷ELISA檢測試劑盒、大鼠OPG ELISA檢測試劑盒、大鼠RANKL ELISA檢測試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司，多聚甲醛、蘇木精、伊紅、切片石蠟、中性樹膠、無水乙醇、二甲苯、磷酸氫二鈉、氯化鈉均購自上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；抗原修復液、免疫組化二抗、DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；免疫染色封閉液購自上海碧云天生物技術有限公司。儀器：小動物成像X線機器 (布魯克全自動臨床前小動物成像系統，型號invivoFX PRO,美國)；Olympus AU2700型全自動生化分析儀；大鼠ELISA檢測測試儀器(酶標分析儀：Rayto RT-6100)；LEICA 2235型輪轉切片機(德國LEICA)；MICROM HM525型冷凍切片機(德國MICROM)；LEICA AUTOSTAINER XL全自動染色機(德國LEICA)；MICROM EC350-1冷熱臺包埋機(德國MICROM)；LEICA ASP300S全自動生物組織脫水機(德國LEICA)；TEC2500病理組織烘漂儀(常州市郝思琳醫用儀器有限公司)。

1.3 體征評分 全身評分，從炎癥出現后，每隔3～4 d進行全身表現評分，評分標準包括，耳:0分=無結節和發紅癥狀，1分=一只耳朵結節和發紅癥狀，2分=兩只耳朵結節和發紅癥狀;鼻:0分=無結締組織腫脹，1分=明顯結締組織腫脹;尾:0分= 無結節，1分=有結節;前足爪:0分=無腫脹，1分=一個前足爪腫脹，2分=兩個前足爪腫脹;后足爪:0分=無腫脹，1分=一個后足爪腫脹，2分=兩個后足爪腫脹；每只大鼠最多評8分[9]。

1.4 放射線檢查 評價關節周圍軟組織腫脹的嚴重程度及關節間隙狹窄、骨質疏松等情況，用10%水合氯醛在CFA免疫后第30天進行麻醉。對繼發炎癥關節和后足通過X射線成像進行檢查。

1.5 骨代謝指標檢測 通過ELISA法對大鼠外周血中血鈣、血磷、骨保護素(OPG)、RANKL指標進行測定。

1.6 大鼠后足關節病理切片AMPK、IL-6、TNF-α免疫組化 切片脫蠟至水：經二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，3次，每次5 min，要確保二甲苯足量有效；無水乙醇2次，每次5 min；95%乙醇2次，每次5 min；蒸餾水2次，每次5 min。采用枸櫞酸抗原修復法熱修復后冷卻至室溫，1×PBS洗3次，每次5 min。免疫染色封閉液室溫封閉15 min，封閉后甩掉封閉液，不洗，加一抗孵育，4 ℃過夜。室溫平衡30 min，PBS洗3次，每次5 min，二抗孵育，37 ℃，30 min；PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色，顯微鏡下觀察確定顯色終點；顯色完畢蘇木精復染核2 min，自來水返藍，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。并使用Image ProPlus軟件對免疫組化結果進行半定量分析，平均光密度值(IOD/area)=累積吸光度值/測量的染色區域的面積，數值越大表示陽性越強，每個實驗組2個樣品。

1.7 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 造模結果 造模30 d時，模型組與正常組相比，繼發側踝關節到趾關節出現紅斑和重度腫脹，MTX組與模型組相比，腫脹程度明顯減輕。二甲雙胍各劑量組，相較于模型組，能夠明顯改善繼發側踝關節腫脹，并且隨著二甲雙胍劑量的升高，改善程度越明顯(見圖1)。

2.2 二甲雙胍對AA大鼠的全身評分的影響 從炎癥出現后，每隔3 d進行全身評分，在病程17 d左右，AA大鼠全身炎癥表現達到高峰，表現為對側(左后肢)明顯。在21 d左右開始，除模型組外，各給藥組大鼠出現全身評分降低，模型組在第24天開始出現評分降低。從病程17 d開始，MTX組和二甲雙胍各劑量組大鼠全身評分均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 各組大鼠全身評分的變化分)

2.3 二甲雙胍對AA大鼠踝關節放射學檢測的影響 藥物治療2周，麻醉后對各組大鼠進行后足X線檢查顯示，造模成功，大鼠出現了RA骨破壞，二甲雙胍可以改善大鼠后足的軟組織腫脹及骨缺失，并可改善AA大鼠骨破壞(見圖2)。

2.4 大鼠血清骨代謝指標檢測 結果顯示，高劑量二甲雙胍可以提高AA大鼠血清鈣、磷水平，不同劑量二甲雙胍均可以提高OPG，降低RANKL的水平，差異均有統計學意義(P<0.01)(見表2)。血清骨代謝指標的變化反映了二甲雙胍可以改善AA大鼠骨破壞。

表2 各組大鼠血清骨代謝相關指標水平的比較

2.5 大鼠膝關節關節組織病理免疫組化 每只大鼠選擇組織切片1張，采用顯微鏡顯影系統，采集圖像。大鼠膝關節AMPK免疫組化結果顯示：正常組大鼠的關節組織中，滑膜細胞呈紡錘狀，細胞核呈藍色，AMPK陽性表達部位呈棕黃色。二甲雙胍高、中劑量組，AMPK免疫組化染色呈現出棕色，部分區域可見褐色，表達亦呈強陽性，但免疫組化染色與正常組相比較減弱。模型組與正常組及二甲雙胍各劑量組比較，AMPK免疫組化染色偶而可見陽性細胞，染色區域顯著降低，染色深度也明顯減弱(見圖3)。大鼠關節IL-6免疫組化結果顯示：正常組大鼠的關節組織中，紡錘狀滑膜細胞細胞核大多呈藍色，IL-6陽性表達部位呈棕黃色。模型組中，IL-6免疫組化染色呈現出棕黃色，表達呈強陽性。二甲雙胍各劑量組，IL-6免疫組化染色滑膜細胞偶而可見陽性細胞，大部分與正常組一樣呈陰性表達(見圖4)。大鼠關節TNF-α免疫組化結果顯示：正常組大鼠的關節組織中，紡錘狀梭型滑膜細胞細胞核呈藍色，TNF-α陽性表達部位呈棕黃色，以陰性表達為主。模型組中，TNF-α免疫組化大量組織染色呈現出棕黃色，表達呈強陽性。二甲雙胍各劑量組中，尤其是二甲雙胍高劑量組TNF-α免疫組化染色偶而可見陽性細胞，大部分與正常組一樣呈陰性表達(見圖5)。對免疫組化結果進行半定量分析結果顯示，二甲雙胍高、中劑量可提高AA大鼠關節免疫組化AMPK蛋白表達；二甲雙胍各劑量均可降低AA大鼠關節免疫組化IL-6蛋白表達；二甲雙胍高、中劑量可以降低AA大鼠關節免疫組化TNF-α蛋白表達，差異均有統計學意義(P<0.01)(見表3)。

表3 各組免疫組化結果(AMPK、IL-6、TNF-α)半定量分析

3 討論

RA的主要病變特征是全身及受累關節周圍骨丟失、骨質破環和關節功能喪失[3]。RA的病情呈進展性，疾病的早期可表現出輕微的骨質破壞，隨著病情的發展，骨質破壞不斷加重[10]。RA病人如果不能得到早期診斷和干預性治療，局部骨破壞可以很快發生，最終導致關節結構破壞，強直畸形，功能喪失，甚至殘廢和全身性的骨質疏松[11]。因此，早期給予RA病人有效的干預治療有重要的意義。但目前，RA骨破壞機制及如何在早期進行及時有效的治療仍是學術界需要不斷探索的問題。

本實驗中，模型組大鼠全身評分明顯增高，存在明顯的軟組織腫脹、骨局部密度降低、骨缺損的情況，并且血清鈣、磷含量明顯減少，說明造模成功，AA大鼠出現了骨破壞。RA骨破壞可能是多種原因綜合導致的,包括某些炎癥因子的作用,免疫功能異常,鈣調節激素異常,鈣攝入不足等因素[12]。血清鈣、磷離子含量作為衡量骨礦化及反映骨形成活性的重要指標，可以間接反映骨組織的代謝情況，血清總鈣的測定對骨代謝及鈣磷代謝的研究具有重要價值[13]。骨中的鈣、磷通過成骨和溶骨作用，不斷與細胞外液進行鈣磷交換，維持血鈣和血磷濃度的相對穩定性。磷可促進骨基質的合成和骨礦物質的沉積，改變骨細胞對鈣的攝人，導致骨細胞結構和功能的改變。TNF-α主要來自于RA微環境中的巨噬細胞和滑膜細胞，以及活化的T細胞，它直接調節骨髓中破骨細胞前體的含量并且能通過增強RANK信號通路激活破骨細胞[14]，也能在成骨細胞系骨髓干細胞中介導RANKL的表達從而間接影響破骨細胞生成。TNF-α可以介導炎癥因子IL-6的產生，有研究指出，RA病人循環系統中IL-6水平與漸進性的關節破壞有關[15]。

關于RA骨破壞的機制，有研究[16]表明，正常骨組織處于成骨細胞導致骨形成和破骨細胞導致骨吸收的動態平衡中。OPG、RANKL、RANK是偶聯成骨細胞、基質細胞和破骨細胞分化與活化的3種主要細胞因子，在骨代謝的過程中起十分重要的調節作用[17-18]。破骨細胞是造血源的多核細胞，是主要的骨吸收細胞。這些細胞是骨破壞的主要介質，分布在RA病人的滑膜上，并在RA的骨上極化。巨噬細胞驅動的破骨細胞形成需要巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)的存在，是RANK和RANKL相互作用的結果[13]。OPG-RANKL-RANK系統是骨代謝的重要環節，在破骨細胞的細胞表面，RANKL可以與RANK的受體激活因子結合，誘導破骨細胞分化、激活和存活。OPG是RANKL的競爭性抑制劑，能夠抑制破骨細胞的分化。我們可以通過調節該系統，延緩骨質破壞，從而控制RA骨破壞的病程進展。

二甲雙胍作為經典一線降糖藥，安全、便宜，不良反應少。除了可以作為降糖藥，它還具有抗炎、抗腫瘤、治療多囊卵巢綜合征、調節代謝等作用。同時，它還可以激活AMPK信號通路，是AMPK的激活劑。AMPK是哺乳動物體內一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是體內能量代謝至關重要的調節因子，AMPK的激活與TNF-α、IL-6等各種炎癥因子表達水平之間存在關聯。同時，AMPK信號通路的激活可能是破骨細胞、RANKL和各種細胞因子之間的關鍵聯系。

通過本實驗可知，二甲雙胍可以改善AA大鼠的炎癥反應，改善骨缺損，且與劑量相關。高劑量組血清鈣磷水平的變化表明，二甲雙胍可以影響骨質疏松大鼠血清鈣磷水平，二甲雙胍促進OPG的合成，降低RANKL的表達，并且呈濃度依賴關系。對骨的礦化過程、骨代謝的平衡維持也有一定的調節作用，對RA骨破壞起到改善作用。本實驗免疫組化結果表明，二甲雙胍作為AMPK的激活劑，高中劑量能增加AA大鼠關節組織中的AMPK水平，降低炎癥因子TNF-α水平，且各劑量組均可降低IL-6水平。二甲雙胍通過激活AMPK信號通路，抑制炎癥因子的產生，促進OPG的合成，降低RANKL的表達，從而影響OPG-RANKL-RANK系統，達到治療RA及其骨破壞的作用。這可能是二甲雙胍治療RA骨破壞的機制之一。

綜上所述，二甲雙胍可以改善AA大鼠的炎癥癥狀，調節RA骨代謝，對骨破壞起到保護作用，且與劑量相關。作用機制可能與其抗炎、調節血清骨代謝指標及激活AMPK信號通路影響OPG-RANKL-RANK系統相關。二甲雙胍作為一線降糖藥物對于糖尿病的治療早已得到肯定。隨著研究的深入，它在骨破壞方面的影響得到了廣泛關注，但大多集中于糖尿病病人骨質疏松或僅僅研究其對RA的作用。這種潛在的骨保護作用是否會改善由RA引起的骨破壞及其機制如何，這是我們正在探索的內容。雖然二甲雙胍的一些促成骨機制仍不十分明確，但相信經過更多的探討及大量的臨床對照研究，二甲雙胍將在各種骨破壞缺損相關疾病的治療中發揮巨大的作用。目前，雖然二甲雙胍作用于骨破壞中的研究取得了一些進展，但是其中的作用機制尚需進一步深入探索。在本課題組后續的工作中，將進一步完善二甲雙胍作用于體外及RA病人骨破壞相關實驗，為臨床治療提供依據。